SECRETARIA
DE MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES
NORMA Oficial
Mexicana NOM-004-SEMARNAT-2002, Protección ambiental.- Lodos y biosólidos.-Especificaciones
y límites máximos permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y
disposición final.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice:
Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales.
NORMA OFICIAL MEXICANA
NOM-004-SEMARNAT-2002, PROTECCION AMBIENTAL.- LODOS Y BIOSOLIDOS.-ESPECIFICACIONES
Y LIMITES MAXIMOS PERMISIBLES DE CONTAMINANTES PARA SU APROVECHAMIENTO Y
DISPOSICION FINAL.
CASSIO LUISELLI FERNANDEZ,
Subsecretario de Fomento y Normatividad Ambiental de la Secretaría de Medio
Ambiente y Recursos Naturales y Presidente
del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Medio Ambiente y Recursos
Naturales, con fundamento en lo dispuesto
en los artículos 32 Bis fracciones I, II, IV, V y 39 fracciones I, VIII y XXI
de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 de la Ley Federal de
Procedimiento Administrativo; 8 fracción V del Reglamento Interior de la
Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales; 5o. fracciones V y VI, 36,
37, 37 Bis, 119, 139 de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección
al Ambiente; 5o. fracción VI y 6o. del Reglamento de la Ley General del
Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente en Materia de Impacto
Ambiental; 38 fracción II, 40 fracciones I y X; 41, 43, 44 y 47 fracción IV de
la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28, 31 fracción II, 33 y 34 de
su Reglamento, expide la siguiente Norma Oficial Mexicana
NOM-004-SEMARNAT-2002, Protección ambiental.- Lodos y biosólidos.-
Especificaciones y límites máximos permisibles de contaminantes para su
aprovechamiento
y disposición final, y
CONSIDERANDO
Que en cumplimiento a lo establecido en la fracción I
del artículo 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, con fecha
18 de febrero de 2002 se publicó en el Diario
Oficial de la Federación, con carácter de proyecto la Norma Oficial
Mexicana PROY-NOM-004-ECOL-2001, Protección ambiental- Lodos y biosólidos-
Especificaciones y límites máximos permisibles de contaminantes para su
aprovechamiento y disposición final, con el fin de que dentro de los 60 días
naturales siguientes a su publicación, los interesados presentaran sus
comentarios ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Medio
Ambiente y Recursos Naturales, sito en bulevar Adolfo Ruiz Cortines número
4209, piso 5o., colonia Jardines en la Montaña, código postal 14210, Delegación
Tlalpan, Distrito Federal o se enviaron al correo electrónico o al fax que para
el efecto se señalaron. Durante el citado plazo, la Manifestación de Impacto
Regulatorio correspondiente estuvo a disposición del público en general para su
consulta en el citado domicilio, de conformidad con el artículo 47 fracción I
del citado ordenamiento.
Que en el plazo de los 60 días antes señalado, los
interesados presentaron sus comentarios al proyecto en cuestión, los cuales
fueron analizados por el citado Comité, realizándose las modificaciones
procedentes al mismo. La Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales
publicó las respuestas a los comentarios recibidos en el Diario Oficial de la Federación el día 18 de junio de 2003.
Que habiéndose cumplido con el procedimiento establecido
en la Ley Federal sobre Metrología y Normalización el Comité Consultivo
Nacional de Normalización de Medio Ambiente y Recursos Naturales, en sesión
ordinaria de fecha 24 de septiembre de 2002, aprobó la Norma Oficial Mexicana NOM-004-SEMARNAT-2002,
Protección ambiental-Lodos y biosólidos-Especificaciones y límites máximos
permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y disposición final. Por
lo expuesto y fundado se expide la siguiente:
NORMA OFICIAL
MEXICANA NOM-004-SEMARNAT-2002, PROTECCION AMBIENTAL-LODOS Y BIOSOLIDOS-ESPECIFICACIONES
Y LIMITES MAXIMOS PERMISIBLES DE CONTAMINANTES PARA SU APROVECHAMIENTO Y
DISPOSICION FINAL
INDICE
0. Introducción
1. Objetivo y campo de aplicación
2. Referencias
3. Definiciones
4. Especificaciones
5. Muestreo y métodos de prueba
6. Evaluación de la conformidad
7. Grado de concordancia con normas
y lineamientos internacionales
8. Bibliografía
9. Observancia de esta Norma
Anexos
I Opciones para la reducción de
atracción de vectores
II Método de muestreo de lodos y
biosólidos
III Método para la cuantificación de
coliformes fecales en lodos y biosólidos
IV Método para la cuantificación de
Salmonella spp., en lodos y
biosólidos
V Método para la cuantificación de
huevos de helmintos en lodos y biosólidos
VI Método para la
cuantificación de metales pesados en biosólidos
VII Contenido de la bitácora de control de lodos y biosólidos
0.
Introducción
En las actividades de desazolve
de los sistemas de alcantarillado urbano o municipal, así como en las
correspondientes a la operación de las plantas potabilizadoras y de plantas de
tratamiento de aguas residuales se generan volúmenes de lodos, que en caso de
no darles una disposición final adecuada, contribuyen de manera importante a la
contaminación de la atmósfera, de las aguas nacionales y de los suelos,
afectando los ecosistemas del área donde se depositen.
Se ha considerado que los lodos
por sus características propias o por las adquiridas después de un proceso de
estabilización pueden ser susceptibles de aprovechamiento siempre y cuando
cumplan con los límites máximos permisibles de contaminantes establecidos en la
presente Norma Oficial Mexicana o, en su caso, se dispongan en forma definitiva
como residuos no peligrosos; para atenuar sus efectos contaminantes para el
medio ambiente y proteger a la población en general.
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1 Objetivo
Esta Norma Oficial Mexicana
establece las especificaciones y los límites máximos permisibles de
contaminantes en los lodos y biosólidos provenientes del desazolve de los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal, de las plantas potabilizadoras y
de las plantas de tratamiento de aguas residuales, con el fin de posibilitar su
aprovechamiento o disposición final y proteger al medio ambiente y la salud humana.
1.2 Campo de aplicación
Es de observancia obligatoria
para todas las personas físicas y morales que generen lodos y biosólidos
provenientes del desazolve de los sistemas de alcantarillado urbano o
municipal, de las plantas potabilizadoras y de las plantas de tratamiento de
aguas residuales.
2. Referencias
Constancia de no peligrosidad de
residuos, anteriormente trámite INE-04-007 modificada su homoclave el 29 de mayo de
2003, mediante el acuerdo por el que se dan a conocer todos los trámites y
servicios inscritos en el Registro Federal de Trámites y Servicios que aplica
la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales, ahora procedimiento SEMARNAT-07-007.
NMX-B-231-1990, Cribas para la
clasificación de materiales granulares, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 27 de diciembre de 1990.
3. Definiciones
Para efectos de la presente
Norma Oficial Mexicana, se establecen las siguientes definiciones:
3.1 Aguas residuales
Las aguas de
composición variada provenientes de las descargas de usos municipales,
industriales, comerciales, de servicios, agrícolas, pecuarios, domésticos,
incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier otro uso, así como la
mezcla de ellas.
3.2 Almacenamiento
Acción de mantener en un sitio los lodos y biosólidos,
hasta su aprovechamiento o disposición final.
3.3 Aprovechamiento
Es el uso de los biosólidos como
mejoradores o acondicionadores de los suelos por su contenido de materia orgánica y nutrientes, o en cualquier actividad que
represente un beneficio.
3.4 Atracción de vectores
Es la característica de los lodos y biosólidos para
atraer vectores como roedores, moscas, mosquitos u otros organismos capaces de
transportar agentes infecciosos.
3.5
Biosólidos
Lodos que han sido sometidos a
procesos de estabilización y que por su contenido de materia orgánica,
nutrientes y características adquiridas después de su estabilización, puedan
ser susceptibles de aprovechamiento.
3.6
Coliformes fecales
Bacterias patógenas presentes en
el intestino de animales de sangre caliente y humanos. Bacilos cortos Gram
negativos no esporulados, también conocidos como coliformes termotolerantes.
Pueden identificarse por su tolerancia a temperaturas de 44°C-45°C. Tienen la
capacidad de fermentar la lactosa a temperatura de 44.5°C. Incluyen al género Escherichia y algunas especies de Klebsiella.
3.7
Desazolve
La acción de extraer sólidos
provenientes de los sistemas de alcantarillado urbano o municipal, no incluye
los provenientes de las presas o vasos de regulación.
3.8
Digestión aerobia
Es la transformación bioquímica
de la materia orgánica presente en los lodos, que es transformada en bióxido de
carbono y agua por los microorganismos en presencia de oxígeno.
3.9 Digestión anaerobia
Es la transformación bioquímica
de la materia orgánica presente en los lodos, que es transformada en gas metano
y bióxido de carbono y agua por los microorganismos en ausencia de oxígeno
disuelto y combinado.
3.10 Disposición final
La acción de depositar de manera permanente lodos y
biosólidos en sitios autorizados.
3.11 Estabilización
Son los procesos físicos, químicos o biológicos a los
que se someten los lodos para acondicionarlos para su aprovechamiento o
disposición final para evitar o reducir sus efectos contaminantes al medio
ambiente.
3.12 Estabilización alcalina
Es el proceso mediante el cual
se añade suficiente cal viva (óxido de calcio CaO) o cal hidratada (hidróxido
de calcio Ca(OH)2) o equivalentes, a la
masa de lodos y biosólidos para elevar el pH.
3.13 Helminto
Término designado a un amplio
grupo de gusanos parásitos (de humanos, animales y vegetales), de vida libre,
con forma y tamaños variados. Poseen órganos diferenciados, y sus ciclos
vitales comprenden la producción de huevos o larvas, infecciosas o no.
3.14 Huevos de helmintos viables
Huevos de helmintos susceptibles de desarrollarse e
infectar.
3.15 La Secretaría
Secretaría de Medio Ambiente y
Recursos Naturales.
3.16
Límite máximo permisible
Valor asignado a un parámetro,
el cual no debe ser excedido por los lodos y biosólidos para que puedan ser
dispuestos o aprovechados.
3.17 Lixiviado
Líquido proveniente de los lodos
y biosólidos, el cual se forma por reacción o percolación y que contiene
contaminantes disueltos o en suspensión.
3.18 Lodos
Son sólidos con un contenido variable de humedad,
provenientes del desazolve de los sistemas de alcantarillado urbano o
municipal, de las plantas potabilizadoras y de las plantas de tratamiento de
aguas residuales, que no han sido sometidos a procesos de estabilización.
3.19 Mejoramiento de
suelos
Es la aplicación de los
biosólidos en terrenos para mejorar sus características físicas, químicas o
microbiológicas.
3.20 Muestra
Parte representativa de un
universo o población finita, obtenida para conocer sus características.
3.21 Parásito
Organismo animal o vegetal que vive sobre o dentro de
un individuo de otra especie.
3.22 Patógeno
Microorganismo capaz de causar enfermedades, si está presente
en cantidad suficiente y condiciones favorables.
3.23 Salmonella spp.
Bacilos mótiles por sus flagelos
perítricos, que fermentan de manera característica glucosa y manosa sin
producir gas, pero no fermentan lactosa ni sacarosa. La mayoría produce sulfuro
de hidrógeno (H2S). A menudo, son patógenos para el hombre y los
animales cuando se ingieren, ocasionando fiebre tifoidea y enterocolitis
(conocida también como gastroenteritis).
3.24
Sistema de alcantarillado urbano o municipal
Es el conjunto de obras y
acciones que permiten la prestación de un servicio público de alcantarillado,
incluyendo el saneamiento, entendiendo como tal la conducción, tratamiento,
alejamiento y descarga de las aguas residuales.
3.25 Sólidos
Totales (ST)
Son los materiales residuales que permanecen en los
lodos y biosólidos, que han sido deshidratados entre 103°C a 105°C, hasta
alcanzar un peso constante y son equivalentes en base a peso seco.
3.26 Sólidos Volátiles (SV)
Son sólidos
orgánicos totales presentes en los lodos y biosólidos, que se volatilizan
cuando éstos se queman a 550°C en presencia de aire por un tiempo determinado.
3.27 Tasa
Específica de Absorción de Oxígeno (TEAO)
Es la masa de oxígeno consumida
por unidad de tiempo y por unidad de masa en peso seco de los sólidos totales
de los lodos y biosólidos.
3.28 Terrenos
con fines agrícolas
Son las superficies sobre las
cuales se pueden cultivar productos agrícolas para consumo humano y animal,
incluyendo los pastizales.
4. Especificaciones
4.1 Las personas físicas o morales interesadas en llevar
a cabo el aprovechamiento o disposición final de los lodos y biosólidos a que
se refiere esta Norma Oficial Mexicana, deberá de recabar la “constancia de no
peligrosidad de los mismos” en términos del trámite SEMARNAT-07-007.
4.1.1 En el caso del proceso de estabilización alcalina,
las muestras de lodos deben ser tomadas antes de ser sometidas a este proceso.
4.2 Los lodos y biosólidos que cumplan con lo establecido
en la especificación 4.1, pueden ser manejados como residuos no peligrosos para
su aprovechamiento o disposición final como se establece en la presente Norma
Oficial Mexicana.
4.3 Para
que los biosólidos puedan ser aprovechados, deben cumplir con la especificación
4.4, 4.5, 4.6, 4.7 y 4.8; y lo establecido en
las tablas 1, 2 y 3 de la presente Norma Oficial Mexicana.
4.4 Los generadores de biosólidos deben controlar la
atracción de vectores, demostrando su efectividad. Para lo cual se pueden
aplicar cualquiera de las opciones descritas, de manera enunciativa pero no
limitativa, en el Anexo 1 u otras que el responsable demuestre que son útiles
para ello. Se deben conservar los registros del control por lo menos durante
los siguientes 5 (cinco) años posteriores a su generación.
4.5 Para
efectos de esta Norma Oficial Mexicana los biosólidos se clasifican en tipo: excelente
y bueno en función de su contenido de metales pesados; y en clase: A, B y C en
función de su contenido de patógenos y parásitos.
4.6 Los
límites máximos permisibles de metales pesados se establecen en la tabla 1.
TABLA 1
LIMITES MAXIMOS PERMISIBLES PARA METALES PESADOS EN BIOSOLIDOS
|
CONTAMINANTE |
EXCELENTES |
BUENOS |
|
Arsénico |
41 |
75 |
|
Cadmio |
39 |
85 |
|
Cromo |
1 200 |
3 000 |
|
Cobre |
1 500 |
4 300 |
|
Plomo |
300 |
840 |
|
Mercurio |
17 |
57 |
|
Níquel |
420 |
420 |
|
Zinc |
2 800 |
7 500 |
4.7 Los
límites máximos permisibles de patógenos y parásitos en los lodos y biosólidos
se establecen en la tabla 2.
TABLA 2
LIMITES MAXIMOS PERMISIBLES PARA
PATOGENOS
Y PARASITOS EN LODOS Y BIOSOLIDOS
|
CLASE |
INDICADOR BACTERIOLOGICO DE CONTAMINACION |
PATOGENOS |
PARASITOS |
|
Coliformes fecales |
Salmonella spp. |
Huevos de helmintos/g |
|
|
A |
Menor de 1 000 |
Menor de 3 |
Menor de 1(a) |
|
B |
Menor de 1 000 |
Menor de 3 |
Menor de 10 |
|
C |
Menor de 2 000 000 |
Menor de 300 |
Menor de 35 |
(a) Huevos de helmintos viables
NMP número más probable
4.8 El aprovechamiento de los biosólidos, se establece en
función del tipo y clase, como se especifica en la tabla 3 y su contenido de
humedad hasta el 85%.
TABLA 3
APROVECHAMIENTO DE BIOSOLIDOS
|
TIPO |
CLASE |
APROVECHAMIENTO |
|
EXCELENTE |
A |
— Usos urbanos con contacto público directo durante su aplicación — Los establecidos para clase B y C |
|
EXCELENTE |
B |
— Usos urbanos sin contacto público directo
durante su aplicación — Los establecidos
para clase C |
|
EXCELENTE |
C |
— Usos forestales — Mejoramientos de suelos — Usos agrícolas |
4.9 La aplicación de los biosólidos en terrenos con fines
agrícolas y mejoramiento de suelos se sujetará a lo establecido en la Ley
Federal de Sanidad Vegetal y conforme a la normatividad
vigente en la materia.
4.10 Para la disposición final de los lodos y biosólidos,
éstos deben cumplir con la especificación 4.1 y con los límites máximos
permisibles para el contenido del indicador de contaminación,
patógenos y parásitos especificados en la tabla 2, para clase C.
4.11 Los sitios para la disposición final de lodos y
biosólidos, serán los que autorice la autoridad competente, conforme a la
normatividad vigente en la materia.
4.12 Los lodos y biosólidos que cumplan con lo establecido
en la presente Norma Oficial Mexicana, pueden ser almacenados hasta por un periodo
de dos años. El predio en el que se almacenen debe ser habilitado para que no
existan infiltraciones al subsuelo y contar con un sistema de recolección de
lixiviados.
4.13 Se
permite la mezcla de dos o más lotes de lodos o biosólidos, siempre y cuando
ninguno de ellos esté clasificado como residuo peligroso y su mezcla resultante
cumpla con lo establecido en la presente Norma Oficial Mexicana.
4.14 Muestreo y análisis de lodos y biosólidos
El generador de
lodos y biosólidos por medio de laboratorios acreditados debe realizar los
muestreos y análisis correspondientes para demostrar el cumplimiento de la
presente Norma Oficial Mexicana y deberá conservar los registros por lo menos
los siguientes 5 (cinco) años posteriores a su realización.
4.15 La frecuencia de muestreo y análisis para
los lodos y biosólidos se realizará en función del volumen de lodos generados
como se establece en la tabla 4.
TABLA 4
FRECUENCIA DE MUESTREO Y ANALISIS
PARA LODOS Y BIOSOLIDOS
|
Volumen generado por año (Ton/Año) |
Frecuencia de |
|
|
Hasta 1,500 |
Una vez al año |
Metales pesados, indicador bacteriológico
de contaminación, patógenos y parásitos |
|
Mayor de 1,500 hasta 15,000 |
Una vez por semestre |
Metales pesados, indicador bacteriológico
de contaminación, patógenos y parásitos |
|
Mayor de 15,000 |
Una vez por trimestre |
Metales pesados, indicador bacteriológico
de contaminación, patógenos y parásitos |
4.16 El generador podrá quedar exento de realizar el
muestreo y análisis de alguno o varios de los parámetros establecidos en la
presente Norma Oficial Mexicana, siempre y cuando la detección de éstos sea en
cantidades menores que los límites máximos establecidos, o cuando por la
procedencia de los lodos y biosólidos éstos no contengan los contaminantes regulados en la presente Norma Oficial
Mexicana, en ambos casos, deberá manifestarlo ante la Secretaría por escrito y
bajo protesta de decir verdad. La autoridad se
reserva el derecho de verificar dicha información.
4.17 El generador deberá contar con una bitácora de
control de lodos y biosólidos, de acuerdo a lo establecido en el Anexo VII.
5.
Muestreo y métodos de prueba
Para el muestreo y determinación de los valores y
concentraciones de los parámetros establecidos en esta Norma, se deberán
aplicar los métodos de prueba establecidos en los anexos II, III, IV, V y VI de
la presente Norma Oficial Mexicana.
6.
Evaluación de la conformidad
La evaluación de la conformidad de la presente Norma
Oficial Mexicana se realizará a petición de parte, de conformidad a lo
dispuesto por la Ley Federal sobre Metrología y Normalización y su Reglamento.
El procedimiento de verificación se realizará por la
PROFEPA o por las unidades de verificación y laboratorios acreditados y aprobados
para llevar a cabo la verificación. En caso de que existan unidades de
verificación acreditadas para la presente Norma, la verificación se realizará
exclusivamente a través de las mismas.
7. Grado de concordancia con normas y lineamientos
internacionales
Esta Norma Oficial Mexicana no
concuerda con ninguna norma o lineamiento internacional, tampoco existen normas
mexicanas que hayan servido de base para su elaboración.
8. Bibliografía
8.1 A Guide
to the Biosolids Risk Assessments for the EPA Part 503 Rule. EPA 832-B-93-005.
Environmental Protection Agency
USA. September 1995. (Guía para la evaluación de riesgos en los biosólidos por
la EPA. Parte 503, Reglamento EPA 832-B-93-005.- Agencia de Protección
Ambiental de Estados Unidos de América. Septiembre 1995).
8.2 A
Plain English Guide to the EPA Part 503 Biosolids Rule. EPA/832/R-93/003.
Environmental Protection Agency USA. September 1994. (Guía sencilla de la EPA.
Parte 503 Biosólidos Reglamento EPA/832/R-93/003.- Agencia de Protección
Ambiental de Estados Unidos de América. Septiembre 1994).
8.3 APHA,
AWWA, WPCF. 1992 Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater. 18th Ed. American Public Health
Association. Washington,
D.C. (Métodos establecidos para el análisis de agua y agua residual. 18ava.
Edición. Asociación Americana de Salud Pública. Washington,
D.C.).
8.4 Biosolids Treatment and Management. Processes for Beneficial Use. Marcel Dekker, Inc. 1996. (Tratamiento y Manejo
de los Biosólidos.- Procesos para Uso Benéfico.- Marcel Dekker, Inc. 1996).
8.5 Campos,
R., Maya, C. y Jiménez, B. “Estabilización Térmica
Alcalina de Lodos Químicos con un Alto Contenido de Microorganismos Patógenos”.
XIX Encuentro Nacional AMIDIQ, Academia Mexicana de Investigación y Docencia en
Ingeniería Química, A.C. Memorias pp. 365-366, Ixtapa- Zihuatanejo, Gro., del
13 al 15 de mayo de 1998.
8.6 Environmental
Regulations and Technology. Use And Disposal Of
Municipal Wastewater Sludge. EPA 625/10-84-003. Environmental Protection Agency USA. September 1984.
(Tecnologías y Regulaciones Ambientales.- Uso y disposición de lodos de aguas
municipales. EPA 625/10-84-003. Agencia de Protección Ambiental de Estados
Unidos de América. Septiembre 1984).
8.7 Environmental
Regulations and Technology. Control of Pathogens in Municipal
Wastewater Sludge. EPA/625/10-89/006. Environmental Protection Agency USA. September 1989.
(Tecnologías y Regulaciones Ambientales.- Control de Patógenos en lodos de
aguas municipales. EPA/625/10-89/006. Agencia de Protección Ambiental de
Estados Unidos de América. Septiembre 1989).
8.8 Fundamento
técnico para la elaboración de la Norma Oficial Mexicana en materia de
estabilización, manejo y aprovechamiento de lodos provenientes de plantas de
tratamiento de aguas municipales e industriales. Instituto de Ingeniería de la
UNAM. 1997.
8.9 Geochemistry,
Groundwater and Pollution. C.A.J. Appelo y D. Postma.- A.A. Balkema/Rotterdam/ Brookfield/1996.
(Geoquímica, aguas subterráneas y contaminación. C.A.J. Appelo y D. Postma.- A.A. Balkema/ Rotterdam/ Brookfield/ 1996).
8.10 Goepfert, J., Olson, N. and Marth, E., 1968. Behavior
of Salmonella typhimurium During
Manufacture and Curing of Cheddar Cheese. Applied Microbiology. 16: 862-866. (Comportamiento de la Salmonella typhimurium durante el procesamiento y curado del queso
Cheddar. Microbiología aplicada 16: 862-866.
8.11 Ground Water, Quality Protection. Larry W. Canter, Robert C. Knox y
Deborah M. Fairchild. Lewis Publishers, Inc. 198 (Aguas subterráneas,
características de protección.- Larry W. Canter,
Robert C. Knox y Deborah M. Fairchild. Lewis Publishers, Inc.
1987).
8.12 Guía
para el manejo, tratamiento y aprovechamiento de lodos residuales de plantas de
tratamiento municipales. Comisión Nacional del Agua. SGIHUI. 1994.
8.13 Guía
para el manejo, estabilización y disposición de lodos químicos. Tema
Potabilización. Comisión Nacional del Agua. SGIHUI. 1994.
8.14 Jawetz, E., Melnick, J. y Adelberg, E., 1995. Microbiología Médica. Ed. Manual
Moderno. México.
pp. 803.
8.15 Jiménez
B., Barrios, J.A. and Maya, C. 1999. Class B
Biosolids Production from Wastewater Sludge with High Pathogenic Content
Generated in an Advanced Primary Treatment.
Disposal and Utilisation of Sewage Sluge: Treatment Methods and Application
Modalities. Water Resources, Hydraulics and Maritime
Engineering NTUA.
Athens, Greece 13-15 October 1999 (Producción de biosólidos clase “B” de los
lodos de aguas residuales con alto contenido patógeno generados en un
tratamiento primario avanzado. Disposición y utilización de lodos residuales.
Métodos de tratamiento y técnicas de aplicación. Recursos de agua, ingeniería
marítima e hidráulica NTUA. Atenas, Grecia, 13-15 octubre 1999).
8.16 Jiménez
C.B., Muñoz C.A. M. y Barrios Pérez, J. A., 1997. Fundamento Técnico para la
Elaboración de la Norma Oficial Mexicana en Materia de Estabilización, Manejo y
Aprovechamiento de Lodos Provenientes de Plantas de Tratamiento de Aguas
Municipales e Industriales. Elaborado para la Comisión Nacional del Agua (CNA)
por el Instituto de Ingeniería, UNAM. Proyecto 8313, pp. 107 (diciembre, 1997).
8.17 Jiménez,
B., Chávez, A., Barrios, J.A., Maya, C. y Salgado, G., 1998. Manual “Curso:
Determinación y Cuantificación de Huevos de Helminto Norma Mexicana
NMX-AA-113-SCFI/992”. Grupo Tratamiento y Reuso, Instituto de Ingeniería UNAM.
pp. 160,
8.18 Jiménez,
B., Maya, C. y Pulido, M., 1996. Evaluación de las Diversas Técnicas para la
Detección de los Huevos de Helminto, y Selección de una para Conformar la NMX
Correspondiente. Instituto de Ingeniería, UNAM. México. pp. 52.
8.19 Ley
General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente. 1996.
8.20 Manual of good practice for utilization of sewage sludge in agriculture. 2nd. Revision october 1991. Anglian Water. (Manual de buenas prácticas para la
utilización de lodos residuales en la Agricultura.- 2a.
Revisión octubre 1991. Agua).
8.21 Miller, V. And Banwart, G., 1965. Effect of Various Concentration
of Brilliant Green and Bile Salts on Salmonellae and Other Microorganisms. Applied Microbiology. 13: 77-80.
(Efecto de varias concentraciones de sales
de verde brillante y biliares en la Salmonella y otros microorganismos.
Microbiología aplicada. 13: 77-80).
8.22 Norma
Oficial Mexicana NOM-001-ECOL/1996, Que establece los límites máximos
permisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y
bienes nacionales. (Diario Oficial de la
Federación 6 de enero de 1997).
8.23 Norma
Oficial Mexicana NOM-008-SCFI/1993, Sistema General de Unidades de Medida. (Diario Oficial de la Federación 14 de
octubre de 1993).
8.24 Norma
Oficial Mexicana NMX-AA-015-1985, Protección al Ambiente-Contaminación del Suelo-Residuos
Sólidos Municipales-Muestreo-Método de Cuarteo-Environmental Protection-Soil Pollution-Municipal
Solid Residues-Sampling-Quarter Method (Diario
Oficial de la Federación 18 de marzo de 1985).
8.25 Norma
Mexicana NMX-AA-113-SCFI/1999, Análisis de Agua.- Determinación de Huevos de
Helminto. Método de Prueba. (Diario
Oficial de la Federación 5 de agosto de 1999).
8.26 Reglamento
de lodos de clarificación. Alemania. 15 de abril de 1992.
8.27 Reglamentación
de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de América
(U.S.E.P.A.) para el Uso o Aplicación de Lodos de Drenaje, Parte 503 del 40
CFR, publicada en el Federal Registry el 19 de febrero de 1993.
8.28 Reglamento
de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente en
materia de Residuos Peligrosos. (Diario
Oficial de la Federación 25 de noviembre de 1988).
8.29 Santos
Mendoza, Salvador. “Estabilización con Cal de Lodos de la Planta Piloto del
Tratamiento Primario Avanzado”. Ingeniería Ambiental, DEPFI- UNAM. 15 de junio
de 1998. Tesis de Maestría.
8.30 Santos
M., S., Campos M., R. y Jiménez C., B. “Una Opción de Manejo para el Lodo
Generado al Tratar el Agua Residual del Gran Canal de la Ciudad de México. 1er.
Simposio Latinoamericano de Tratamiento y Reuso del Agua y Residuos
Industriales. Memorias Tomo I, pp. 28-1-28-10, del 25 al 29 de mayo de 1998,
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8.31 Satchwell, G.M., 1986. An Adaptation of Concentration Techniques for the Enumeration of
Parasitic Helminth Eggs from Sewage Sludge (Adaptación de la Técnica de
Concentración para la Enumeración de Huevos de Helmintos Parásitos Provenientes
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8.32 Schaffner, C., Mosbach K., Bibit V. and Watson C., 1967. Coconut and Salmonella Infection.
Applied Microbiology. 15: 471-475. (Infección de la Salmonella y coco. Microbiología aplicada. 15: 471-475).
8.33 Shiflett M., Lee J. and Sinnhuber, R., 1967. Effect of
Food Additives and Irradiation on Survival of Salmonella in Oysters. Applied Microbiology. 15: 476-479. (Efecto de aditivos
alimenticios e irradiación en la supervivencia de la Salmonella en ostras. Microbiología
aplicada. 15: 476-479).
8.34 Silliker, J. Deibel, R. and Chiu, J., 1964. Ocurrence
of Gram-Positive Organisms Possessing Characteristics Similar to Those of Salmonella and the Practical Problem of
Rapid and Definitive Salmonella Identification.
Applied
Microbiology. 12: 395-399. (Aparición de organismos Gram positivos, poseyendo
características similares a la Salmonella,
y el problema práctico de identificación rápida y definitiva de Salmonella. Microbiología aplicada. 12: 395-399).
8.35 Silliker, J., Deibel, R. and Fagan, P., 1964. Isolation of Salmonella from Food Samples: VI
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from Egg Products. Applied Microbiology. 12: 224- 228. (Aislamiento de
la Salmonella de muestras
alimenticias: VI. Comparación de métodos para el aislamiento de la Salmonella desde productos de huevo. Microbiología aplicada. 12:
224-228.
8.36 Sludge Management & Disposal. For The Practicing
Engineer. P.A. Vesilind, G.C., Hartman y E.T., Skene. Lewis Publishers, Inc. 1986. (Manejo y disposición de lodos. Para Ingenieros
Profesionales. P.A. Vesilind, G.C. Hartman y E.T., Skene. Lewis Publishers, Inc. 1986).
8.37 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th. Edition. American Public Health
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agua y aguas residuales, 19th. Edición Asociación Americana de salud pública.
Asociación Americana de aguas tratadas. Federación
Ambiental del Agua 1995).
8.38 Sludge Stabilization. Manual of Practice FD-9. Facilities Development. Water
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Agua 1993).
8.39 Standards for the Use or Disposal of Sewage Sludge; Final Rules. 40 CFR Parts 257, 403 and 503. Environmental
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8.40 Sludge Conditioning. Manual of Practice FD-14. Water Pollution Control Federation. 1988. Alexandria, VA. (Manual de prácticas de
acondicionamiento de lodos FD-14. Federación para el control de la
contaminación en el agua. 1988.) y Alejandría, V. A.
8.41 Stuart, P. and Pivnick, H., 1965. Isolation
of Salmonellae by Selective Motility
Systems Applied Microbiology 13: 365-372 (Aislamiento de la Salmonella por selectos sistemas de
motilidad. Microbiología aplicada 13: 365-372).
8.42
8.43
8.44 US EPA/625/R92/013 1992, Environmental Regulation and Technology, Control
of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge pp. 152. (Tecnología y Regulación
Ambiental. Control de patógenos y atracción de vectores en lodos residuales).
9. Observancia de esta Norma
9.1 La
vigilancia del cumplimiento de la presente Norma Oficial Mexicana corresponde a
la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales, por conducto de la
Procuraduría Federal de Protección al Ambiente, así como a los gobiernos
estatales, municipales y del Distrito Federal, en el ámbito de sus respectivas
competencias. Las violaciones a la misma se sancionarán en los términos de la
Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente, sus reglamentos
y demás ordenamientos jurídicos aplicables. La Secretaría de Medio Ambiente y Recursos
Naturales, por conducto de la Procuraduría Federal de Protección al Ambiente,
así como los gobiernos estatales, municipales y del Distrito Federal, en el
ámbito de su respectiva competencia, llevarán a cabo de manera periódica o
aleatoria los muestreos y análisis de los lodos y biosólidos,
con objeto de verificar el cumplimiento de los límites máximos permisibles de
contaminantes establecidos en la presente Norma Oficial Mexicana.
TRANSITORIOS
PRIMERO.- La
presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigor a los 60 días posteriores al
de su publicación en el Diario Oficial
de la Federación.
SEGUNDO.-
Con fundamento en lo dispuesto en el artículo 47 fracción IV de la Ley Federal
sobre Metrología y Normalización, provéase la publicación de este proyecto en
el Diario Oficial de la Federación.
México, Distrito Federal, a los quince
días del mes de abril de dos mil tres.- El Subsecretario de Fomento y
Normatividad Ambiental de la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales,
y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Medio Ambiente
y Recursos Naturales, Cassio Luiselli
Fernández.- Rúbrica.
ANEXO
I
OPCIONES PARA LA
REDUCCION DE ATRACCION DE VECTORES
Los responsables podrán aplicar cualquiera de las
siguientes opciones para el control de atracción de vectores o cualquier otra
que se demuestre que es efectiva.
Opción 1:
Reducción en el contenido de sólidos volátiles
La atracción de vectores se reduce si la masa de
sólidos volátiles en los biosólidos es reducida por lo menos un 38% durante su
tratamiento. Este porcentaje es equivalente al conseguido mediante digestión
aeróbica o anaeróbica más alguna reducción adicional que ocurra después de que
los biosólidos salen de las instalaciones de estabilización, tales como el
procesamiento en lechos de secado o lagunas o mediante el composteo.
Opción 2:
Digestión adicional de los biosólidos digeridos anaeróbicamente
Frecuentemente, los biosólidos han sido reciclados a
través del tratamiento biológico de las aguas residuales o han transitado durante
largos periodos por los sistemas de alcantarillado. Durante este tiempo, sufren
una degradación biológica sustancial. Si los biosólidos son subsecuentemente
tratados mediante digestión anaerobia, su atracción de vectores será reducida
adecuadamente. Debido a que ingresan al digestor parcialmente
estabilizados, la reducción de sólidos volátiles después del tratamiento
frecuentemente es menor de 38%. Bajo estas circunstancias, pudiera no ser
factible la reducción de 38% requerida en la opción 1. La opción 2 permite al
operador demostrar la reducción de atracción de vectores probando una porción
de los biosólidos previamente digeridos en una unidad a escala de laboratorio.
Se demuestra la reducción, si después de la digestión anaerobia de los
biosólidos por 40 días adicionales, a una temperatura entre 30°C y 37°C, la
reducción de los sólidos volátiles en los biosólidos es menor de 17%.
Opción 3:
Digestión adicional de los biosólidos digeridos aeróbicamente
Esta opción es apropiada para los biosólidos digeridos
aeróbicamente que no pueden cumplir con la opción 1, incluye a aquellos
producidos por plantas de aireación extendida donde el tiempo mínimo de
residencia para los biosólidos en el tren de aguas generalmente excede de 20
días. En estos casos, los biosólidos ya estarán sustancialmente degradados antes
de la digestión aerobia.
Bajo esta opción, se considera que los biosólidos
digeridos aeróbicamente con 2% de sólidos o menos, han logrado la reducción de
atracción de vectores si después de 30 días de digestión aerobia en una prueba
de laboratorio a 20°C, la reducción de los sólidos volátiles es menor de 15%.
Esta prueba solamente es aplicable a los biosólidos líquidos digeridos
aeróbicamente.
Opción 4:
Procesos aerobios a más de 40oC
Esta opción se aplica primordialmente a los biosólidos
composteados que también contienen agentes abultadores orgánicos parcialmente
descompuestos. Los biosólidos deben ser tratados aeróbicamente por 14 días o
más, tiempo durante el cual la temperatura deberá rebasar siempre los 40°C y el
promedio será mayor de 45°C. Esta opción pudiera aplicarse a otros procesos
aeróbicos, tales como la digestión aeróbica, sin embargo, las opciones 3 y 4
parecen más fáciles de cumplir para los otros procesos aeróbicos.
Opción 5:
Adición de materia alcalina
Se considera que los biosólidos reducen adecuadamente
su atracción de vectores si se adiciona suficiente materia alcalina para lograr
lo siguiente:
¿ Elevar el pH
por lo menos hasta 12, medido a 25°C, y sin añadir más materia alcalina,
mantenerlo por 2 horas, y
¿ Mantener un
pH de al menos 11,5 sin la adición de más materia alcalina durante otras 22
horas.
Estas condiciones tienen la intención de asegurar que
los biosólidos puedan ser almacenados por lo menos durante varios días en las
instalaciones de tratamiento, transportados y posteriormente aplicados sin que
el pH descienda a niveles en los que ocurre la putrefacción y se atraen
vectores.
Opción 6:
Reducción en la humedad de biosólidos que no contienen sólidos sin estabilizar
Se considera que la atracción de vectores se reduce si
los biosólidos no contienen sólidos sin estabilizar generados durante el
tratamiento primario y su contenido de sólidos es por lo menos del 75% antes de
ser mezclados con otros materiales. Por consiguiente, la reducción debe
lograrse removiendo agua y no mediante la adición de materiales inertes.
Es importante que los biosólidos no contengan sólidos
sin estabilizar porque los desechos de comida parcialmente degradados que
seguramente existen en tales biosólidos atraerían a pájaros, algunos mamíferos
y posiblemente a insectos aun si el contenido de sólidos es mayor del 75%.
Opción 7:
Reducción en la humedad de biosólidos que contienen sólidos no estabilizados
Se considera que la habilidad para atraer vectores de
cualesquier biosólido se reduce adecuadamente si su contenido de sólidos se
incrementa al 90% o más sin importar si se trata de biosólidos provenientes del
tratamiento primario. El incremento debe conseguirse removiendo agua y no
mediante la dilución con sólidos inertes.
El secado hasta este punto limita severamente la actividad biológica y destroza
o descompone los compuestos volátiles que atraen vectores.
La manera en que se manejan los biosólidos secos,
incluyendo su almacenamiento antes de la aplicación puede propiciar la
atracción de vectores. Si éstos se exponen a una humedad alta, la superficie
exterior tendrá un alto contenido de humedad y posiblemente atraerá vectores.
Esto debe ser prevenido adecuadamente.
Opción 8:
Tasa específica de absorción de oxígeno (TEAO) para biosólidos digeridos
aeróbicamente
Frecuentemente, los biosólidos digeridos aeróbicamente
son circulados a través de los procesos biológicos de tratamiento aeróbico de
las aguas residuales hasta por 30 días. En estos casos, los biosólidos que entran
al digestor aeróbico ya están parcialmente digeridos, lo cual dificulta cumplir
con la Opción 1.
La Tasa Específica de Absorción de Oxígeno (TEAO) es la masa de oxígeno consumida por unidad de
tiempo y por unidad de masa en peso seco de los sólidos totales de los
biosólidos. La reducción en la atracción de vectores puede demostrarse
si la TEAO de los biosólidos que son aplicados, determinada a 20°C, es igual o
menor de 1,5 mg de O2/h/g de sólidos totales (peso seco).
Esta prueba se basa en el hecho de que, si los
biosólidos consumen muy poco oxígeno, su valor como fuente alimenticia para los
microorganismos es muy baja como para atraerlos. Se pueden utilizar otras
temperaturas para la prueba si los resultados se corrigen sobre la base de
20°C. Esta prueba solamente es aplicable a los biosólidos aeróbicos.
Opción 9:
Incorporación de biosólidos al suelo
Los biosólidos deben ser incorporados al suelo dentro
de las 6 horas posteriores a su aplicación sobre el terreno. La incorporación
se consigue arando o mediante algún otro método que mezcle los biosólidos con el
suelo. Si los biosólidos son Clase A con respecto a patógenos, el tiempo entre
la aplicación y el procesado no debe exceder de 8 horas.
ANEXO II
METODOS DE MUESTREO DE LODOS Y BIOSOLIDOS
Consiste en obtener una porción del volumen generado,
la cual debe conservar la integridad de todos sus constituyentes desde el
momento en que es tomada la muestra (parte representativa de un universo o
población finita obtenida para conocer sus características) y hasta el final de
su análisis o determinación en el laboratorio. El tiempo en que éstas
permanecen estables dependerá de sus características y método de preservación
utilizado. El muestreo constituye una parte integral y fundamental para evaluar
la calidad de los lodos y biosólidos, para su depósito final.
El tamaño y número de muestras dependen de las fuentes
generadoras, así como de los procesos utilizados para su estabilización. Es
importante considerar la selección del sitio de muestreo, la homogeneidad y
representatividad de la muestra, el grado de degradación, el volumen, tipo de
análisis y la accesibilidad al sitio seleccionado para el muestreo.
1. Método
Obtener muestras representativas de lodos y biosólidos
para determinar su contenido de Coliformes fecales, Salmonella spp., huevos de helmintos, tasa específica de absorción
de oxígeno, contenido de sólidos totales y sólidos volátiles, arsénico, cadmio,
cromo, cobre, plomo, mercurio, níquel y zinc.
1.1 Equipo y materiales
Sólo se relacionan
los equipos y materiales que son de relevancia para el presente método.
1.1.1 Equipo.
1.1.1.1 Báscula con capacidad mínima de 100 kg y precisión de
10 g.
1.1.1.2 Báscula con
capacidad mínima de 10 kg y precisión de 1 g.
1.1.1.3 Criba M 2.00 según
Norma Mexicana NMX-B-231-1990.
1.1.2 Materiales.
1.1.2.1 Bieldos.
1.1.2.2 Bolsas de polietileno de 0,70 m x 0,50 m y calibre
mínimo del No. 200.
1.1.2.3 Bolsas de polietileno de 1,10 m x 0,90 m y calibre
mínimo del No. 200.
1.1.2.4 Botas de hule.
1.1.2.5 Brocha de tamaño adecuado para la limpieza.
1.1.2.6 Cascos de seguridad.
1.1.2.7 Escobas.
1.1.2.8 Guantes de carnaza.
1.1.2.9 Ligas de hule de 1,5 mm de ancho.
1.1.2.10 Marcadores de tinta permanente, preferentemente color
negro.
1.1.2.11 Mascarillas protectoras.
1.1.2.12 Overoles.
1.1.2.13 Papelería y varios (formatos de muestreo, lápices,
gomas y otros).
1.1.2.14 Papelería y varios (informe de campo, marcadores,
ligas, etc.).
1.1.2.15 Palas curvas.
1.1.2.16 Recogedores.
1.1.2.17 Tablas de inventario, tamaño carta u oficio.
1.1.2.18 Tambos metálicos de forma cilíndrica, con capacidad de
20 L.
1.1.2.19 Bolsas de polietileno estéril sin pastilla de
tiosulfato o recipientes de polietileno o propileno inerte, de boca
ancha y con tapa y cierre hermético, de 500 ml de capacidad y susceptibles de
ser esterilizados en autoclave, para coliformes fecales.
1.1.2.20 Recipientes de
polietileno o propileno inerte o de vidrio, de boca ancha y con tapa y cierre
hermético, de 50 ml, para metales.
1.1.2.21 Recipientes
de polietileno o propileno inerte, de boca ancha y con tapa y cierre hermético,
de 500 ml de capacidad, para huevos de
helmintos, sólidos y TEAO.
2. Tipos de
lodos
2.1. Muestras líquidas o semisólidas
Colectar la muestra directamente del vertedor en un
recipiente de plástico de 20 L, hasta obtener el doble del volumen por utilizar
para cada uno de los análisis por realizar, como mínimo.
2.1.1 Tuberías
Colectar la
muestra directamente de la tubería a través del grifo de purga que presente un
diámetro interno mínimo de 3,8 cm.
2.1.2 Canales
Colectar la
muestra en el vertedor o en otro punto donde el lodo esté bien mezclado.
2.1.3 Digestores
Colectar la
muestra de un tanque mezclado que es alimentado a través de líneas provenientes
de diferentes niveles en el digestor. Antes del muestreo asegurarse de eliminar
el lodo acumulado previamente en las líneas.
2.1.4 Tanques
Mezclar
completamente el tanque y colectar varias muestras a diferentes profundidades y
puntos. Juntar todas las muestras en una sola antes de realizar el análisis.
2.1.5 Lodos de sitios específicos
en plantas de tratamiento
Los siguientes
puntos de muestreo se recomiendan para el muestreo de lodo en plantas de
tratamiento de agua residual.
2.1.6 Lodo primario
Conducir el
lodo desde el tanque de estabilización hasta el cárcamo antes del bombeo,
mezclar perfectamente y colectar una muestra representativa en este punto.
Alternativamente colectar muestras de la bomba de lodos y de las tuberías,
cercanas a éstas.
2.1.7 Lodo activado
Colectar
muestras en:
a) cárcamo
de bombeo
b) de la
bomba o tubería adyacente
c) del
punto de descarga de los lodos de retorno al afluente primario
El punto de
muestreo se debe localizar en una región de buena agitación para la suspensión
de sólidos.
2.1.8 Lodo digerido
Colectar
muestras en la tubería de descarga del digestor al equipo o lechos de secado.
2.1.9 Lodos del lecho de secado
Colectar
muestras del mismo tamaño en diferentes puntos del lecho sin incluir arena.
Mezclar totalmente.
2.1.10 Lodo filtrado
Colectar porciones del mismo tamaño (utilizar
cortadores de galletas) en la descarga del filtro.
2.1.11 Azolves
Para el caso de los azolves, aplica cuando ha sido
extraída una muestra representativa de la zona donde se encuentran depositados.
2.2 Muestras sólidas
Para conformar las muestras se usa el método del
cuarteo. Para eso:
Se toman de 4 a 8 bolsas de polietileno de 0,70 m x
0,50 m o 1,10 m x 0,90 m, se selecciona al azar el mismo número de sitios
diferentes. Posteriormente, se llena cada una de las bolsas con el material de
cada sitio y se trasladan a un área plana horizontal de aproximadamente 4 m x 4
m, preferentemente de cemento pulido o similar y bajo techo y se deposita su
contenido en montículo.
Traspalear el material con pala o bieldo, para obtener
una mezcla homogénea. A continuación, dividir en cuatro partes aproximadamente
iguales A, B, C y D y eliminar las partes opuestas A y C o B y D. Repetir esta
operación hasta dejar 10 kg aproximadamente de lodo o biosólido. La pila
resultante sirve para determinar en el laboratorio el contenido de Coliformes
fecales, Salmonella ssp., huevos de
helmintos, contenido de sólidos totales y
sólidos volátiles, arsénico, cadmio, cromo, cobre, plomo, mercurio, níquel y
zinc. El material restante se usa para determinar el peso volumétrico de los
lodos in situ, conforme al punto 8.
Trasladar la muestra al laboratorio en bolsas de
polietileno debidamente selladas e identificadas (véase marcado). Evitar que queden expuestas al sol durante su transporte,
además tener cuidado en el manejo de la bolsa que contiene la muestra para que
no sufra ninguna ruptura. El tiempo máximo de transporte de la muestra al
laboratorio, no debe exceder de 8 horas.
3. Preparación
de la muestra
La secuencia
del muestreo por parámetro se debe realizar conforme con lo descrito en los
puntos correspondiente con el propósito de minimizar sesgos en los resultados.
4. Recipientes
para cada parámetro
A la muestra,
antes de ser procesada, se le determinará el contenido de sólidos totales en
por ciento en peso, para el caso del TEAO el contenido de éstos deberá ser
menor o igual al 2%.
4.1 Coliformes fecales y Salmonella spp.
Los recipientes
de polietileno o polipropileno inerte de
500 ml de capacidad, antes del muestreo deben ser esterilizados
preferentemente en autoclave. Posteriormente, se deposita la muestra que
corresponda a 4 g de sólidos totales. Etiquetarlo y mantenerlo en refrigeración
hasta su análisis.
4.2 Huevos de helmintos, Sólidos totales y
Sólidos volátiles y TEAO
Los recipientes
de polietileno o polipropileno inerte de
500 ml de capacidad, antes de la toma de muestra deben ser enjuagados
primero con agua potable a chorro y luego con agua destilada.
Para el caso de
huevos de helmintos, se toma el peso en fresco que corresponda a 2 g de sólidos
totales. Para el caso de sólidos totales y volátiles y TEAO se llenan los
recipientes hasta un 75% de su capacidad total, se cierran, etiquetan y
mantienen en refrigeración, hasta su análisis, excepto para TEAO que se
mantiene a temperatura ambiente.
4.3 Compuestos inorgánicos: arsénico, cadmio, cobre, cromo, mercurio, níquel,
plomo y zinc
El recipiente
de polietileno o polipropileno inerte de vidrio de 50 ml de capacidad, antes de
la toma de muestra se debe enjuagar primero con agua potable a chorro y luego
destilada.
Posteriormente,
se deposita la muestra hasta el total de la capacidad, se cierra, se etiqueta y
se mantiene en refrigeración hasta su análisis.
4.4 Preservación y
almacenamiento de la muestra
La preservación
y tiempo máximo para el análisis de cada uno de los parámetros es la siguiente:
PARAMETROS |
PRESERVACION * |
TIEMPO MAXIMO |
|
Coliformes
fecales y Salmonella spp. |
4°C |
48 horas |
|
Huevos de
helmintos |
4°C |
30 días |
|
Arsénico,
cadmio, cobre, cromo, níquel, plomo y zinc |
4°C |
180 días |
|
Mercurio |
4°C |
13 díasa (plástico) 38 díasb (vidrio) |
|
Sólidos totales |
4°C |
24 horas |
|
Sólidos
volátiles |
4°C |
24 horas |
|
Tasa específica
de absorción de oxígeno ** |
No requiere |
Inmediato |
*A partir de su toma y hasta
antes de iniciar el análisis, la muestra debe mantenerse en refrigeración.
**Si la muestra es tomada en el laboratorio, debe mantenerse la temperatura constante o ambiente durante el transporte y analizarla inmediatamente.
5. Control de calidad
El programa de
muestreo debe operar un sistema control de la calidad.
5.1 El responsable del muestreo debe mantener los
registros de los nombres y títulos de los técnicos que realizaron el muestreo y
el del encargado de control de calidad que verificó los mismos y las bitácoras
o formatos en los que se contengan cuando menos la siguiente información:
a) Identificación
de la muestra.
b) Cantidad
de muestra utilizada.
c) Tipo
de muestra.
d) Tipo
de análisis a realizar.
e) Además,
debe mantener la información original reportada por el personal técnico que
intervino en el muestreo, traslado y recepción de las muestras, así como de la
información complementaria.
6. Etiquetado
La muestra se identifica con una etiqueta, la cual
debe contener la siguiente información:
— Localidad,
Municipio y Estado.
— Fecha y hora
del cuarteo.
— Condiciones climatológicas.
— Cantidad de
lodos tomados para el cuarteo, en kg.
— Cantidad de
lodos obtenidos para la selección en subproductos, en kg.
— Datos del
responsable del cuarteo.
— Observaciones.
7. Cálculos
7.1 Para determinar el peso volumétrico del lodo se
utilizan recipientes limpios, sin abolladuras. La báscula empleada deberá estar
nivelada.
7.2 A continuación se pesa el recipiente vacío, tomando
este peso como la tara del recipiente. Se llena hasta el tope con el lodo
homogeneizado obtenido de las partes eliminadas del primer cuarteo (descrito
anteriormente).
7.3 El recipiente se golpea contra el suelo tres veces
dejándolo caer desde una altura de 10 cm. Llenar hasta el tope teniendo cuidado
de no presionar al colocarlo en el recipiente; esto con el fin de no alterar el
peso volumétrico que se pretende determinar.
7.4 Es importante vaciar
dentro del recipiente todo el material, sin descartar los finos. Para obtener
el peso neto del lodo, se pesa el recipiente con éstos y se resta el valor de
la tara. Cuando no se tenga suficiente cantidad de material para llenar el
recipiente se marca en éste la altura alcanzada y se determina dicho volumen.
El peso volumétrico del lodo se
calcula mediante la siguiente fórmula:
(1)
donde:
Pv: Peso volumétrico del lodo, en kg/m3
P: Peso del lodo (peso
bruto menos tara), en kg
V: Volumen del recipiente, en m3
8. Interferencias
Colectar las muestras en el momento cuando el parámetro a analizar es
inestable, por ejemplo la Tasa Específica de Absorción de Oxígeno (TEAO), o
cuando se requiere realizar lo antes posible el análisis (por ejemplo el
análisis microbiológico).
ANEXO III
METODO PARA LA CUANTIFICACION DE COLIFORMES FECALES EN LODOS Y BIOSOLIDOS
El presente
método establece la técnica para llevar a cabo la cuantificación del grupo
coliformes fecales en lodos y biosólidos, con el fin de evaluar la calidad y la
eficiencia de los diferentes tratamientos, y es aplicable para la evaluación de
la calidad de lodos y biosólidos.
1. Principios del método
Este método
de análisis se basa en que:
1.1 Las bacterias presentes en una muestra pueden ser
separadas por agitación, dando por resultado una suspensión de células
bacterianas, uniformemente distribuidas.
1.2 A través de diluciones sucesivas de la muestra se
obtienen inóculos de, al menos, una célula para obtener crecimiento en el medio
de cultivo (tubos positivos), y otros que al sembrarse dan resultado en por lo
menos, un tubo de la serie.
1.3 La combinación de resultados positivos y negativos
permite realizar una estimación de la densidad bacteriana por medio de cálculos
de probabilidad.
1.4 La
técnica seleccionada permite el estudio de un volumen de muestra suficiente
para obtener resultados significativos, considerando la alta turbidez que la
muestra pudiera presentar a causa de la gran cantidad de material acumulado. En
caso de aplicar técnicas como filtro de membrana se correría el riesgo de un
cálculo de coliformes fecales inferior al real.
2. Muestreo, preparación y acondicionamiento de la muestra
El muestreo constituye una parte
integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de calidad de lodo.
2.1 La
muestra deberá ser tomada en frascos de 500 ml de capacidad, de boca ancha y
previamente esterilizados.
2.2 Las
muestras deben ser colocadas en hieleras con bolsas refrigerantes o hielo
inmediatamente después de su toma.
2.3 Los
tiempos de conservación en refrigeración y transporte deben reducirse al
mínimo.
2.4 A la
muestra, antes de ser procesada, se le determinará el contenido de sólidos
totales (ST) en por ciento en peso y posteriormente se obtendrá el peso en
fresco que corresponda a 4 g de ST.
2.5 A
partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en
refrigeración y no transcurrir más de 48 horas.
3. Reactivos y materiales
3.1. Reactivos
3.1.1 Alcohol etílico.
3.1.2 Caldo
lauril-triptosa con púrpura de bromocresol (C.L.T.).
3.1.3 Caldo lactosado con púrpura de
bromocresol (C.L.).
3.1.4 Medio EC.
3.1.5 Fosfato monopotásico.
3.1.6 Cloruro de magnesio.
3.1.7 Hidróxido de sodio.
3.1.8 Agua destilada.
3.2 Materiales
3.2.1 Asa
de inoculación.
3.2.2 Barras
magnéticas.
3.2.3 Bulbo
de goma.
3.2.4 Espátula.
3.2.5 Frascos
de 500 ml de capacidad con tapa de cierre hermético, boca ancha y con capacidad
de esterilización en autoclave.
3.2.6 Gradillas
y canastillas de acero inoxidable.
3.2.7 Guantes
de látex.
3.2.8 Mechero
de Bunsen, lámpara de alcohol o similar.
3.2.9 Pipetas
graduadas de vidrio de 1,5 y 10 ml.
3.2.10 Portapipeteros
de acero inoxidable.
3.2.11 Tapabocas.
3.2.12 Tapones de acero inoxidable para
tubos de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o de 12 mm x 120 mm).
3.2.13 Tubos
de Durham (7 mm x 4,5 mm o de 5 mm x 4 mm).
3.2.14 Tubos de ensayo (18 mm x 180 mm,
16 mm x 150 mm o 12 mm x 120 mm).
3.2.15 Tubos
de rosca (13 mm x 100 mm).
4. Aparatos e instrumentos
4.1 Autoclave
a una presión de 1,05 kg/cm2 y una temperatura de 121°C.
4.2 Balanza
analítica con intervalo de medición de 0,0001 a 10,00 g.
4.3 Balanza
granataria con intervalo de medición de 0,1 a 100 g.
4.4 Baño de agua (con agitación) con
capacidad para operar a una temperatura de 44,5°C ± 0,2°C.
4.5 Estufa de esterilización con capacidad para medir temperatura
de 170°C ± 10°C.
4.6 Incubadora
con capacidad para operar a una temperatura de 37°C ± 0,2°C.
4.7 Parrilla
con agitación y calentamiento.
4.8 Potenciómetro
con intervalo de medición de 6,9°C ± 0,2°C.
4.9 Refrigerador con capacidad para
operar a una temperatura entre 2 y 4°C ± 0,2°C.
5. Procedimiento
Los puntos siguientes describen
la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo
descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.
5.1 Preparación de medios de cultivo y soluciones
5.1.1 Caldo lauril-triptosa con púrpura de bromocresol
(C.L.T.).
|
Fórmula |
|
|
Triptosa |
20,00 g |
|
Lactosa |
05,00 g |
|
Fosfato
dipotásico (K 2HPO 4) |
02,75 g |
|
Fosfato
monopotásico(KH2 PO4) |
02,75 g |
|
Cloruro
de sodio(NaCl) |
05,00 g |
|
Lauril
sulfato de sodio |
00,10 g |
|
Púrpura
de bromocresol |
00,01 g |
|
Agua
destilada |
1 000,00 ml |
Disolver los ingredientes o 35,6 g del medio que se encuentra en forma
deshidratada en el mercado y 0,01 g de púrpura de bromocresol, con la ayuda de una
parrilla de agitación, en 1 L de agua destilada.
Verificar que el pH sea de 6,8 ± 0,2, en
caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Distribuir en volúmenes de 10
ml en tubos de ensayo. Tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en
autoclave a 121°C, durante 15 minutos.
El volumen
final no debe variar más de 0,1 ml.
El medio ya
una vez preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio
y libre de polvo, durante no más de una semana.
5.1.2 Caldo lactosado con púrpura de bromocresol (C.L.).
|
Fórmula |
|
|
Extracto
de carne |
06,00 g |
|
Peptona |
10,00 g |
|
Lactosa |
10,00 g |
|
Púrpura
de bromocresol |
0,01 g |
|
Agua
destilada |
1 000,00 ml |
Disolver
los ingredientes o 13,0 g del medio C.L. que se encuentra en forma deshidratada
en el mercado y 0,01 g de púrpura de bromocresol, con la ayuda de una parrilla
de agitación, en 1 L de agua destilada.
Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustar con
una solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Distribuir volúmenes de 10 ml del medio en tubos de
ensayo. Tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a 121°C,
durante 15 minutos.
El volumen
final no debe variar más de 0,1 ml.
El medio ya
una vez preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio
y libre de polvo, durante no más de una semana.
5.1.3 Medio líquido A-1
|
Fórmula |
|
|
Lactosa
|
5,00 g |
|
Triptosa
|
20,00 g |
|
Cloruro
de sodio (NaCl) |
5,00 g |
|
Salicina |
0,50 g |
|
Eter
p-isooctilfenil de polietilenglicol (Tritón X-100 y Haas, o equivalente) |
01,00 ml |
|
Agua
destilada |
1 000,00 ml |
Calentar hasta la disolución de
los ingredientes sólidos. Añadir el éter p-isooctifenil de polietilenglicol.
Verificar
que el pH sea de 6,9 ± 0,1, en
caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Distribuir volúmenes de 10 ml
en tubos de ensayo con campana de Durham, tapar con tapones de aluminio. Esterilizar
en autoclave a 121°C durante 10 minutos.
Este medio se debe conservar en
oscuridad a temperatura ambiente durante no más de 7 días.
5.1.4 Medio
EC
|
Fórmula |
|
|
Triptosa o tripticasa |
20,00 g |
|
Lactosa |
05,00 g |
|
Mezcla de sales biliares |
1,50 g |
|
Fosfato dipotásico (K2HPO4)
|
4,00 g |
|
Fosfato monopotásico (KH2
PO4) |
1,50 g |
|
Cloruro de sodio (NaCl) |
5,00 g |
|
Agua destilada |
1 000,00 ml |
Disolver los ingredientes o 37,0
g del medio EC que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, con la
ayuda de una parrilla de agitación, en 1 L de agua destilada. Verificar que el
pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución
de hidróxido de sodio 0,1 N.
Distribuir volúmenes de 10 ml
del medio en tubos de ensayo, conteniendo en su interior tubos de Durham
invertidos, tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a
121°C, durante 15 minutos. El volumen final no debe variar más de 0,1 ml.
El medio ya preparado puede
almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de polvo,
durante no más de una semana.
5.1.5 Solución
madre de tampón A
|
Fórmula |
|
|
Fosfato monopotásico (KH2PO4)
|
34,00 g |
|
Agua destilada |
1 000,00 ml |
Disolver el fosfato monopotásico
en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con la solución de hidróxido de sodio 1 N y aforar a 1 L de
agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos y
almacenar en refrigeración (entre 2 y 4°C). La solución es estable durante
meses. Desechar cuando se observe turbiedad.
5.1.6 Solución
madre de tampón B
|
Fórmula |
|
|
Cloruro de magnesio (MgCl2
.6H2O) |
8,10 g |
|
Agua destilada |
1 000,00 ml |
Disolver el cloruro de sodio de
magnesio en 500 ml de agua destilada y aforar a 1 000 ml con agua destilada,
posteriormente esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Almacenar
en refrigeración (entre 2 y 4°C). La solución es estable durante meses,
desechar cuando haya turbiedad.
Solución tampón de fosfatos
(agua de dilución).
5.1.7 Adicionar
1,25 ml de la solución madre de tampón A y 5 ml de la solución madre de tampón
B y aforar a 1 L con agua destilada. Distribuir volúmenes de 9,2 ml y 36 ml en
tubos de rosca y frascos con tapa de cierre hermético, respectivamente.
Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos y almacenar a temperatura
ambiente.
5.1.8 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N
|
Fórmula |
|
|
Hidróxido de sodio (NaOH) |
04,00 g |
|
Agua recién destilada |
1 000,00 ml |
Preparación:
Pesar 4,0 g de hidróxido de
sodio y disolver en 1 000 ml de agua recién destilada y libre de CO2
para abatir la carbonatación de la solución. Almacenar en frasco con tapón de
rosca.
5.1.9 Solución de hidróxido de sodio 1 N
|
Fórmula |
|
|
Hidróxido de sodio (NaOH) |
40,00 g |
|
Agua recién destilada |
1 000,00 ml |
Preparación:
Pesar 40 g de hidróxido de sodio
y disolver en 1 000 ml de agua recién destilada y libre de CO2 para
abatir la carbonatación de la solución. Almacenar en frasco con tapón de rosca.
5.2 Calibración
de aparatos
Todos los equipos utilizados
deben ser calibrados o ajustados de acuerdo a las especificaciones del fabricante
o bien contra equipos certificados.
5.3 Seguridad
Durante el procesado de la muestra se debe utilizar
guantes de látex y cubrebocas, para evitar cualquier riesgo de infección.
Se debe lavar y desinfectar el
área de trabajo, así como el material utilizado por el analista, antes y
después del ensayo.
5.4 Manejo
de residuos
Todos los residuos de la muestra
analizada y sobrantes serán esterilizados en autoclave antes de su desecho.
5.5 Preparación
de la muestra
a) Suspender
X g de materia fresca que correspondan a 4 g de sólidos totales en 36 ml de
agua de dilución y así obtener una dilución de 10-1.
b) Mezclar
durante 2 o 3 minutos, con ayuda de una parrilla de agitación, a velocidad baja
(800 rpm), hasta la completa disolución.
5.6 Preparación
de diluciones
Por el origen de las muestras se
requieren inóculos menores a 1 ml, utilizando diluciones seriadas de
submúltiplos de 10.
a) Se
preparan diluciones decimales seriadas a partir del homogeneizado resultante
(10-1) lo antes posible, reduciendo al mínimo la sedimentación.
Transferir 1 ml en 9 ml de agua de dilución (10-2) y así
sucesivamente hasta obtener la dilución deseada.
b) Cada
dilución debe ser homogeneizada perfectamente agitando 25 veces en 7 segundos,
haciendo un arco con la muñeca de 30 cm de arriba abajo o con un sistema de
agitación que proporcione resultados equivalentes. Es importante efectuar la
agitación siempre de la misma manera, para obtener resultados comparables.
c) Se
debe utilizar una pipeta estéril diferente, para cada una de las diluciones
decimales subsecuentes. Para aforar el líquido de la pipeta, deberá aplicarse
la punta de ésta en el interior del cuello manteniéndola en posición vertical,
inclinando el tubo. Nunca se debe introducir, a la muestra, más de la tercera
parte de la pipeta.
d) Si una
muestra o un lote de muestras va a ser analizado por primera vez, utilizar al
menos cuatro series de tres (o cinco) tubos cada una, posteriormente tres
series de tres tubos serán suficientes.
5.7 Determinación
de coliformes fecales
5.7.1 Prueba
directa (medio A-1)
La prueba directa del medio
líquido A-1 es un método de un solo paso que no requiere confirmación. Sin
embargo, su uso representa un mayor costo ya que este medio no se encuentra en
forma deshidratada, siendo necesario prepararlo a partir de sus ingredientes
básicos.
a) Adicionar
por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en tubos
conteniendo líquido A-1 correctamente etiquetados. Incubar durante 3 horas a 35
± 0,5° C.
b) Una
vez transcurrido el tiempo los tubos se transfieren a un baño de agua a una
temperatura de 44,5 ± 0,2°C y se incuban durante otras
21 ± 2 horas.
c) La
presencia de gas en cualquier cultivo en medio A-1 a las 24 horas o menos de
incubación es una reacción positiva que indica la existencia de coliformes de
origen fecal.
5.7.2
Prueba indirecta
5.7.2.1 Prueba
presuntiva (caldo lauril-triptosa o caldo lactosado)
a) Transferir
1 ml de las diluciones seleccionadas a cada una de las series de tubos
correspondientes conteniendo el caldo lauril o caldo lactosado e incubar a 35 ±
0,5°C.
b) Examinar
cada tubo a las 24 ± 2 horas. La acidificación, con o sin producción
de gas (cambio de coloración de púrpura a amarillo), a partir de la
fermentación de la lactosa en el medio de cultivo, indica una prueba presuntiva
positiva de la presencia de bacterias del grupo coliformes. En caso contrario
reincubar durante otras 24 horas más.
c) La
acidificación del medio, con o sin formación de gas dentro de las 48 ± 3 horas, constituye una prueba
presuntiva positiva. Cuando no existe acidificación del medio, constituye una
prueba.
5.7.2.2 Prueba
confirmativa flama del (medio EC)
a) Los
tubos positivos de la prueba presuntiva se resiembran por triple asada
(esterilizada al mechero y enfriada) en tubos de fermentación presuntiva
negativa que contengan caldo EC e incubados a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua.
b) Examinar
cada tubo a las 24 ± 2 horas.
c) El
resultado será positivo cuando haya producción de gas a partir de la
fermentación de la lactosa contenida en el medio EC. Los tubos sin formación de
gas se desechan.
6. Cálculos
6.1. El
NMP de coliformes fecales se obtiene a partir del código compuesto por los
tubos con resultado positivo en el medio EC o en A-1. Si se inoculan tres
series de tres tubos y se utilizan volúmenes decimales diferentes a los
indicados en la tabla, se obtiene el código formado por el número de tubos con
resultados positivos en las tres series consecutivas, verificando el valor del
NMP correspondiente, a través de la siguiente fórmula:
NMP=(NMP de tablas) X (10/mayor volumen inoculado) (1)
Por ejemplo: en medio EC se
obtuvo el código 3/3 para la serie de la dilución 0,01; 2/3 para la serie de la
dilución 0,001 y 1/3 para la serie de la dilución 0,0001.
6.2 El
código es de 3, 2, 1; el índice de coliformes en tabla es de 150, por lo que el
resultado es:
6.3 Cuando
se inoculan más de tres volúmenes decimales, para la composición del código se
utilizan los resultados positivos correspondientes a tres series consecutivas
inoculadas.
6.4 En
ocasiones algunos de los posibles resultados de tubos múltiples son omitidos de
las tablas del NMP. Así los códigos como 0-0-3, 0-0-4 y 0-0-5 junto con muchos
otros, no están incluidos. Ello se debe a que la probabilidad de su ocurrencia
es muy baja. Si en un laboratorio dichos resultados improbables aparecen con
una frecuencia mayor de 1%, es posible que se deban a procedimientos
equivocados en el mismo, por lo que deben ser revisados. Cuando el código del
NMP no aparezca en tablas, se utilizará la siguiente fórmula:
NMP = (Número de tubos positivos
x 100)/ Ö [(ml
muestra tubos neg.) x (ml muestra total)] (4)
La frecuencia de obtención de
resultados que no se encuentren en las tablas debe ser baja (< 1%), de otra
forma se tendrá que revisar y confirmar el procedimiento de la prueba.
7. Expresión de resultados
7.1. La
densidad de los coliformes fecales se expresa como NMP de coliformes por g de
materia seca o ST, el cual se obtiene a partir de tablas ya establecidas, las
cuales incluyen los límites de confianza al 95% para cada una de las
combinaciones de tres (o cinco) series de tubos positivos posibles. Para su
utilización se proporcionan códigos formados por tres algoritmos correspondientes
al número de tubos con resultados positivos en tres series consecutivas.
7.2. Interferencias
La posible presencia de otras
bacterias que producen ácido a partir de lactosa, lo que se elimina en la
prueba confirmativa a la temperatura de 44,5°C.
Es importante que los tubos de
Durham colocados en los tubos de fermentación, una vez preparados y
esterilizados, no presenten aire en su interior. En caso contrario se pueden
obtener resultados positivos falsos.
8. Informe de prueba
El informe de prueba incluye especificar
los siguientes puntos:
a) Todos
los datos necesarios para la identificación completa de la muestra;
b) Los
resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8, y
c) Cualquier
suceso particular observado durante el curso del análisis, así como cualquier
operación no especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber
influido en los resultados.
ANEXO IV
METODO PARA LA
CUANTIFICACION DE Salmonella spp. EN LODOS Y BIOSOLIDOS
El presente método establece la
técnica para llevar a cabo la cuantificación de Salmonella spp. mediante la técnica de
tubos múltiples o número más probable (NMP) en lodos y biosólidos, con el fin
de evaluar su calidad y la eficiencia de los tratamientos de los mismos. Este
método es aplicable para la evaluación de la calidad de los lodos y biosólidos.
1. Principio
Este método de análisis se basa
en los siguientes principios:
1.1 A
partir de un enriquecimiento con medios selectivos, que contienen sustancias
inhibidoras, se favorece la multiplicación de Salmonella spp., reconstituyendo a su vez la vitalidad de las
células dañadas y, de igual forma, impidiendo el desarrollo de bacterias
coliformes asociadas.
1.2 Una
vez realizada la selección, las bacterias presentes en una muestra pueden ser
separadas por agitación, dando por resultado una suspensión de células
bacterianas, uniformemente distribuidas, a través de diluciones sucesivas de la
muestra.
1.3 La
aplicación de pruebas bioquímicas que permiten conocer el perfil bioquímico de
las cepas en estudio para compararlo, con el que generalmente exhiben las cepas
del género Salmonella spp.
2. Muestreo, preparación y acondicionamiento de la muestra
El muestreo constituye una parte
integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de calidad del lodo,
por lo cual, éste deberá efectuarse de acuerdo a lo referido en el Anexo II de
esta Norma.
2.1 La
muestra deberá ser tomada en frascos de 500 ml de capacidad, de boca ancha y
previamente esterilizados.
2.2 Las
muestras deben ser colocadas en hieleras con bolsas refrigerantes o hielo
inmediatamente después de su toma.
2.3 Los
tiempos de conservación en refrigeración y transporte deben reducirse al
mínimo.
2.4 A la
muestra, antes de ser procesada, se le determinará el contenido de sólidos
totales (ST) en por ciento en peso y posteriormente se obtendrá el peso en
fresco que corresponda a 4 g de ST.
2.5 A
partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en
refrigeración y no transcurrir más de 48 horas.
3. Reactivos y materiales
3.1 Reactivos
3.1.1 Agar
Hierro Lisina (LIA).
3.1.2 Agar
Sulfito de Bismuto.
3.1.3 Agar
Triple Azúcar Hierro (TSI).
3.1.4 Agar
Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD).
3.1.5 Alcohol
etílico.
3.1.6 Caldo
de Selenito Cistina.
3.1.7 Caldo
de Tetrationato.
3.1.8 Cloruro
de magnesio.
3.1.9 Cristales
de yodo.
3.1.10 Fosfato
monopotásico.
3.1.11 Solución
de hidróxido de sodio 0,1 N.
3.1.12 Solución
de hidróxido de sodio 1 N.
3.1.13 Solución
tampón de fosfatos (agua de dilución).
3.1.14 Verde
brillante.
3.1.15 Yoduro
de potasio
3.2 Materiales
3.2.1
Barras magnéticas.
3.2.2
Bulbo de goma.
3.2.3 Cajas
Petri estériles (100 x 15 mm.).
3.2.4 Espátula.
3.2.5 Frascos
de 100 ml de capacidad con tapa de cierre hermético y capacidad de esterilizado
en autoclave.
3.2.6 Frascos
de 1 L de capacidad con tapa de cierre hermética.
3.2.7 Gradillas
y canastillas de acero inoxidable, matraces Erlenmeyer de vidrio, de 1 y 2 L de
capacidad.
3.2.8 Guantes
de látex.
3.2.9 Matraz
aforado de 1 L.
3.2.10 Mechero
de Bunsen, lámpara de alcohol o similar.
3.2.11 Pipetas
graduadas de vidrio de 1, 5 y 10 ml.
3.2.12 Portapipeteros
de acero inoxidable.
3.2.13 Tapabocas.
3.2.14 Tapones de acero inoxidable para
tubos de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o 12 mm x 120 mm).
3.2.15 Tubos de ensayo (18 mm x 180 mm,
16 mm x 150 mm o de 12 mm x 120 mm).
3.2.16 Tubos
de rosca (13 mm x 100 mm).
4. Aparatos e instrumentos
4.1 Autoclave
a una presión de 1,05 kg/cm2, y una temperatura de 121°C.
4.2 Balanza
analítica con intervalo de medición de 0,000 1 a 10,00 g.
4.3 Balanza
granataria con intervalo de medición de 0,1 a 100 g.
4.4 Baño de agua (con agitación) con
capacidad para operar a una temperatura de 44,5°C ± 0,2°C.
4.5 Estufa u horno con capacidad
para operar a una temperatura de 180°C ±
10°C.
4.6 Incubadora
con capacidad para operar a una temperatura de 37°C ± 0,2°C.
4.7 Incubadora
con capacidad para operar a una temperatura de 41°C ± 0,2°C.
4.8 Parrilla
con agitación y calentamiento.
4.9 Potenciómetro
con intervalo de medición de 6,5 a 7,5 ± 0,2 pH.
4.10 Refrigerador
con capacidad para operar entre 2 y 4°C ± 0,5°C.
5. Procedimiento
Los siguientes puntos describen
la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo
descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.
5.1 Preparación
de medios de cultivo y soluciones
5.1.1 Caldo
tetrationato
|
Fórmula |
|
|
Proteosa peptona o triptona |
05,00 g |
|
Sales biliares |
01,00 g |
|
Carbonato de calcio |
10,00 g |
|
Tiosulfato de sodio |
30,00 g |
|
Agua destilada |
1 000,00 ml |
Disolver los ingredientes o 16 g
del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en agua
destilada y calentar hasta ebullición, posteriormente distribuir en volúmenes
de 100 ml en recipientes estériles y conservar entre 5 y 8°C. Antes de usar el
medio, agregar 2 ml de solución de yodo yoduro y 1 ml de solución de verde
brillante 1:1 000 por cada 100 ml de caldo, a cada recipiente.
Una vez que la solución de yodo
yoduro ha sido adicionada al medio, éste deberá ser utilizado de forma
inmediata. Nunca se debe volver a calentar.
5.1.2 Caldo
selenito cistina
|
Fórmula |
|
|
Triptona o polipeptona |
05,00 g |
|
Lactosa |
04,00 g |
|
Fosfato disódico |
10,00 g |
|
Selenito ácido de sodio |
04,00 g |
|
L- Cistina |
00,01 g |
|
Agua destilada |
1 000,00 ml |
Preparación:
Disolver
los ingredientes o 23 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el
mercado, en agua destilada. Calentar hasta ebullición durante 10 minutos en un
baño de agua y distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos de ensayo, para
esterilizar 10 minutos por arrastre de vapor. Verificar que el pH sea de
7,0 ± 0,2, en caso contrario ajustar
con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.
El medio se
debe utilizar el mismo día de su preparación.
5.1.3 Agar sulfito de bismuto
|
Fórmula |
|
|
Extracto
de carne de res |
05,00 g |
|
Peptona
|
10,00 g |
|
Glucosa
|
05,00 g |
|
Fosfato
disódico (anhidro) |
04,00 g |
|
Sulfato
ferroso (anhidro) |
00,30 g |
|
Sulfito
de bismuto |
08,00 g |
|
Verde
brillante |
00,025 g |
|
Agar
|
20,00 g |
|
Agua
destilada |
1 000,00 ml |
Suspender
los ingredientes o 52 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el
mercado, en 1 L de agua destilada,
calentar hasta su disolución completa, agitando frecuentemente.
Verificar que el pH sea de 7,6 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una
solución de hidróxido de sodio 0,1 N.
Enfriar a
60°C y distribuir en cajas de Petri estériles.
El medio no
debe esterilizarse en autoclave, el sobrecalentamiento afecta su selectividad.
5.1.4 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
|
Fórmula |
|
|
Xilosa
|
03,75 g |
|
L
Lisina |
05,00 g |
|
Lactosa
|
07,50 g |
|
Sacarosa
|
07,50 g |
|
Cloruro
de sodio |
05,00 g |
|
Extracto
de levadura |
03,00 g |
|
Rojo
de fenol |
00,08 g |
|
Agar
|
15,00 g |
|
Tiosulfato
de sodio |
06,80 g |
|
Desoxicolato
de sodio |
02,50 g |
|
Citrato
de hierro y amonio |
00,80 g |
|
Agua
destilada |
1 000,00 ml |
Suspender
los ingredientes o 52 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el
mercado, en 1L de agua destilada. Agitar frecuentemente y dejar que hierva
durante 1 minuto, evitar un sobrecalentamiento, si bien, su reacción puede ser
satisfactoria, las colonias tienden a ser muy pequeñas. El medio nunca se debe
esterilizar en autoclave.
Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2,
en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.
Enfriar a
no menos de 50°C pero abajo de 60°C y vaciar en cajas Petri estériles.
5.1.5 Agar
verde brillante (VB)
|
Fórmula |
|
|
Extracto de levadura |
03,00 g |
|
Proteosa peptona número 3
polipeptona |
10,00 g |
|
Cloruro de sodio |
05,00 g |
|
Lactosa |
10,00 g |
|
Sacarosa |
10,00 g |
|
Rojo de fenol |
00,08 g |
|
Verde brillante |
00,012 5 g |
|
Agar |
20,00 g |
Preparación
Suspender los ingredientes o lo
indicado por el medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en
1 L de agua destilada, mezclar bien y calentar hasta ebullición. Verificar que
el pH sea de 6,9 ± 0,1 en caso contrario ajustarlo con una solución de
hidróxido de sodio 0,1 N.
Esterilizar en autoclave a 121°C
por 12 minutos, cualquier sobrecalentamiento del medio disminuye su
selectividad. Enfriar a no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en
cajas de Petri estériles.
5.1.6 Agar
S.S.
|
Fórmula |
|
|
Extracto de carne |
05,00 g |
|
*Polipeptona |
05,00 g |
|
Lactosa |
10,00 g |
|
Sales biliares |
08,50 g |
|
Citrato de sodio |
08,50 g |
|
Tiosulfato de sodio |
08,05 g |
|
Citrato férrico |
01,00 g |
|
Agar |
13,50 g |
|
Verde brillante solución al 0,1% |
00,33 g |
|
Rojo neutro |
00,25 g |
* La polipeptona se puede
sustituir por 2,5 gramos de peptona de caseína y 2,5 gramos de peptona de
carne.
Suspender los ingredientes o 60
g del medio que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en 1 L de
agua destilada y calentar a ebullición hasta disolución completa. No
esterilizar en autoclave. Posteriormente verificar que el pH sea de 7,0 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con
una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.
Enfriar a no menos de 50°C pero
debajo de 60°C y distribuir en cajas Petri estériles.
5.1.7 Agar
nutritivo**
|
Fórmula |
|
|
Extracto de carne |
03,00 g |
|
Peptona |
05,00 g |
|
Agar |
15,00 g |
|
Agua destilada |
1 000,00 ml |
** Se puede sustituir por agar infusión
cerebro-corazón o similar.
Suspender
los ingredientes en agua, dejar reposar entre 5 y 10 minutos, calentar a
ebullición hasta su completa disolución, para posteriormente verificar que el
pH sea de 6,8 ± 0,2, en caso
contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N y esterilizar
a 121°C por 15 minutos. Dejar enfriar a no menos de 50°C y debajo de 60°C y
distribuir en cajas Petri estériles.
5.1.8 Agar triple azúcar hierro (TSI)
|
Fórmula |
|
|
Polipeptona |
20,00 g |
|
Cloruro de sodio |
05,00 g |
|
Lactosa |
10,00 g |
|
Sacarosa |
10,00 g |
|
Glucosa |
01,00 g |
|
Sulfato ferroso amónico |
00,20 g |
|
Tiosulfato de sodio |
00,20 g |
|
Rojo de fenol |
00,025 g |
|
Agar |
13,00 g |
|
Agua destilada |
1 000,00 ml |
Suspender
los ingredientes o 65 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el
mercado, en 1L de agua destilada;
mezclar perfectamente y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta su
completa disolución. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de
sodio 0,1 N.
Enfriar a
60°C y distribuir en volúmenes de 4 ml en tubos de rosca y esterilizar a 121°C
durante 15 minutos. Los tubos se inclinan, de manera que el medio de cultivo en
el fondo alcance una altura de 3 cm y una parte inclinada de 2 a 3 cm.
5.1.9 Agar hierro lisina (LIA)
|
Fórmula |
|
|
Peptona
o gelisato |
05,00 g |
|
Extracto
de levadura |
03,00 g |
|
Glucosa
|
01,00 g |
|
L
Lisina |
10,00 g |
|
Citrato
férrico amónico |
00,50 g |
|
Tiosulfato
de sodio |
00,04 g |
|
Púrpura
de bromocresol |
00,02 g |
|
Agua
destilada |
1 000,00 ml |
Suspender
los componentes o según indicaciones del medio que se encuentra en forma
deshidratada en el mercado, en 1 L de agua destilada, y calentar hasta
ebullición con agitación frecuente. Verificar que el pH sea de 6,7 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una
solución de hidróxido de sodio 0,1 N.
Enfriar a
no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en volúmenes de 4 ml en tubos
de rosca, para esterilizar en presión a 121°C por 12 minutos. Posteriormente
dejar enfriar los tubos en posición inclinada, de tal modo que se obtengan
columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.
5.1.10 Solución madre de tampón A
|
Fórmula |
|
|
Fosfato
monopotásico (KH2PO4) |
34,00 g |
|
Agua
destilada |
1 000,00 ml |
Disolver el fosfato monopotásico
en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con la solución de hidróxido de sodio 1 N y aforar a 1 000 ml
con agua destilada y esterilizar en autoclave a una presión de 1,05 kg/cm2
y una temperatura de 121°C, durante 15 minutos. Almacenar en refrigeración entre
2 y 4°C.
La solución es estable durante
meses, pero se debe desechar cuando se observe turbiedad.
5.1.11 Solución
madre de tampón B
|
Fórmula |
|
|
Cloruro de magnesio (MgCl2
.6H2O) |
81,00 g |
|
Agua destilada |
1 000,00 ml |
Disolver el cloruro de magnesio
en 500 ml de agua destilada y aforar a 1 000 ml con agua destilada y esterilizar
a 121°C durante 15 minutos. Almacenar en refrigeración entre 2 y 4°C. La
solución es estable durante meses, pero se debe desechar cuando se observe
turbiedad.
5.1.12 Solución
tampón de fosfatos (agua de dilución)
Adicionar 1,25 ml de la solución
patrón A y 5 ml de la solución patrón B y aforar a 1 L con agua destilada, para
distribuir volúmenes de 9,2 ml y 36 ml en tubos de rosca y frascos con tapa de
cierre hermético, respectivamente, y esterilizar en autoclave a una presión de
1,05 kg/cm2 y una temperatura de 121°C, durante 15 minutos.
Almacenar a temperatura ambiente.
5.1.13 Solución
de hidróxido de sodio 0,1 N
|
Fórmula |
|
|
Hidróxido de sodio (NaOH) |
04,00 g |
|
Agua recién destilada |
1 000,00 ml |
Preparación:
Pesar 4,0 gramos de hidróxido de
sodio y disolver en 1 000 ml de agua recién destilada y libre de CO2
para abatir la carbonatación de la solución y almacenar en frasco con tapón de
rosca.
5.1.14 Solución
de hidróxido de sodio 1 N
|
Fórmula |
|
|
Hidróxido de sodio (NaOH) |
40,00 g |
|
Agua recién destilada |
1 000,00 ml |
Preparación:
Pesar 40,0 gramos de hidróxido
de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recién destilada y libre de CO2
para abatir la carbonatación de la solución, almacenar en frasco con tapón de
rosca.
5.1.15 Solución
de yodo yoduro
|
Fórmula |
|
|
Cristales de yodo |
06,00 g |
|
Yoduro de potasio |
06,00 g |
|
Agua destilada |
20,00 ml |
Disolver el yoduro de potasio en
el agua destilada y agregar lentamente los cristales de yodo hasta su completa
disolución y almacenar en oscuridad.
5.2 Calibración
de aparatos
Todos los equipos utilizados
deben ser calibrados o ajustados de acuerdo a las especificaciones del
fabricante o bien contra equipos certificados.
5.3 Seguridad
Durante el procesado de la
muestra se deben utilizar guantes de látex y cubrebocas, para evitar cualquier
riesgo de infección.
Se debe lavar y desinfectar el
área de trabajo, así como el material utilizado por el analista, antes y
después del ensayo.
5.4 Manejo
de residuos
Todos los residuos de la muestra
analizada y sobrantes serán esterilizados en autoclave antes de su desecho.
5.5 Preparación
de la muestra
a) Suspender
X gramos de materia fresca que correspondan a 4 gramos de sólidos totales en 36
ml de agua de dilución y así obtener una dilución de 10-1.
b) Mezclar
durante 2 o 3 minutos, con ayuda de una parrilla de agitación, a velocidad baja
(800 rpm), hasta la completa disolución.
5.6 Enriquecimiento
a) Suspender
X g de materia fresca que correspondan a 4 g de sólidos totales en 36 ml de
caldo de tetrationato, obteniendo una dilución de 10-1.
b) Mezclar
durante 2 o 3 minutos, con la ayuda de una parrilla de agitación, a baja
velocidad (800 rpm) hasta la completa disolución.
c) Incubar
durante 22 ± 2 horas a 37°C ± 0,2°C.
5.7 Preparación
de diluciones
a) Una
vez transcurrido el tiempo de incubación, preparar las diluciones decimales
seriadas transfiriendo 1 ml de caldo de tetrationato en 9 ml de agua de
dilución (10-2) y así sucesivamente hasta obtener la dilución
deseada.
b) En
cada dilución se debe homogeneizar perfectamente agitando 25 veces en 7
segundos, haciendo un arco con la muñeca de 30 cm de arriba a abajo o con un
sistema de agitación que proporcione resultados equivalentes. Es importante
efectuar la agitación siempre de la misma manera, para obtener resultados
comparables y utilizar una pipeta estéril diferente, para cada una de las
diluciones decimales subsecuentes.
c) Adicionar
por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en tubos
conteniendo caldo selenito cistina correctamente etiquetados. Para aforar el
líquido de la pipeta, deberá aplicarse la punta de ésta en el interior del
cuello manteniéndola en posición vertical, inclinando el tubo. Nunca se debe
introducir en la muestra, más de la tercera parte de la pipeta.
d) Incubar
durante 24 ± 2 horas a 41°C ± 0,2°C.
e) Realizar
la observación del virado de coloración, considerando un color anaranjado
intenso como positivo de la prueba correspondiente.
5.8 Aislamiento
e identificación bioquímica de Salmonella
spp.
a) El
aislamiento y la identificación no son indispensables para la cuantificación de
Salmonella spp., pero son necesarios
como control para el laboratorio de que las bacterias fueron correctamente
identificadas.
b) A
partir de un cierto número de tubos positivos (con virado anaranjado), con la
ayuda de un asa, sembrar por estría para obtener colonias aisladas sobre la
superficie de placas de alguno de los medios diferenciales selectivos. Los
medios utilizados pueden ser agar verde brillante, agar sulfito de bismuto,
agar XLD, agar SS.
c) Incubar
a 35°C durante 24 horas.
d)
Observar los cultivos para identificar las colonias sospechosas para Salmonella spp. como
sigue:
— agar verde brillante: colonias rojas o rosas rodeadas del
medio rojo.
— agar bismuto de sulfito: colonias negras con o sin brillo metálico,
rodeadas de un halo café que posteriormente se transforma en negro.
— agar XLD: colonias rojas, generalmente presentan el centro
negro.
— agar SS: colonias translúcidas, transparentes u opacas y
algunas veces con centro negro.
e) Para
la identificación bioquímica se seleccionan al menos 2 colonias típicas
sospechosas de cada placa, que se encuentren bien aisladas.
f) Tocar
con un asa recta cada colonia e inocular por estría en una placa conteniendo
agar nutritivo (u otro medio similar). Incubar a 35°C ± 0,2°C por 24 horas.
g) A
partir de colonias perfectamente aisladas inocular 2 tubos, uno con agar triple
azúcar y hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la
superficie inclinada y por picadura en el fondo. Incubar a 35°C durante 24
horas.
h) Observar
el crecimiento en los tubos y considerar positivas las colonias que den las
siguientes reacciones:
— agar TSI: en el fondo del tubo se
observa virado color amarillo debido a la fermentación de la glucosa, en la
superficie del medio se intensifica el color rojo. En la mayoría de los casos
se observa coloración negra a lo largo de la picadura, debido a la producción
de H2S.
— agar LIA: se observa coloración púrpura en todo el tubo, en
ocasiones se observa la producción de H2S, con ennegrecimiento a lo
largo de la picadura.
i) Existen
pruebas alternas cualitativas, aunque de mayor costo, que pueden ser empleadas
como es el caso de la prueba miniaturizada API-20E y la confirmación serológica
que permiten identificar la especie y el
serotipo, respectivamente.
j) Si el
laboratorio lo prefiere es factible utilizar el caldo de selenito cistina como
medio de enriquecimiento y el caldo de tetrationato como medio selectivo.
6. Cálculos
6.1 El
NMP de Salmonella spp. se obtiene a partir del código compuesto por los tubos con
resultado positivo en el caldo de selenito cistina. Si se inoculan tres series
de tres tubos y se utilizan volúmenes decimales diferentes a los indicados en
tablas, se obtienen el código formado por el número de tubos con resultados
positivos en las tres series consecutivas, verificando el valor del NMP
correspondiente, a través de la siguiente fórmula:
NMP =
(NMP de tablas) x (10/mayor volumen inoculado) (1)
Por ejemplo: en medio selenito
cistina se obtuvo el código 3/3 para la serie de la dilución 0,1; 2/3 para la
serie de la dilución 0,01 y 1/3 para la serie de la dilución 0,001.
El código es de 3, 2, 1 al
consultar en las tablas obtenemos un valor de 150, el resultado es:
6.2 Cuando
se inoculan más de tres volúmenes decimales, para la composición del código se
utilizan los resultados positivos correspondientes a tres series consecutivas
inoculadas.
6.3 En
ocasiones algunos de los posibles resultados de tubos múltiples son omitidos de
las tablas del NMP. Así los códigos como 0-0-3, 0-0-4 y 0-0-5 junto con muchos
otros, no están incluidos. Ello se debe a que la probabilidad de su ocurrencia
es muy baja. Si en un laboratorio dichos resultados improbables aparecen con una
frecuencia mayor de 1%, es posible que se deban a procedimientos equivocados en
el mismo, por lo que deben ser revisados. Cuando el código del NMP no aparezca
en tablas, se utilizará la siguiente fórmula:
NMP = (Número
de tubos positivos x 100)/ Ö [(ml muestra tubos neg.) x (ml
muestra total)] (4)
La frecuencia de obtención de
resultados que no se encuentren en las tablas debe ser baja (menor 1%), de otra
forma se tendrá que revisar y confirmar.
7. Expresión de resultados
7.1 La
densidad de Salmonella spp. se expresa como NMP de coliformes por g de materia seca o
ST, el cual se obtiene a partir de tablas ya establecidas, las cuales incluyen
los límites de confianza al 95% para cada una de las combinaciones de tres (o
cinco) series de tubos positivos posibles.
7.2 Para
su utilización se proporcionan códigos formados por tres algoritmos
correspondientes al número de tubos con resultados positivos en tres series
consecutivas.
8. Informe de prueba
El informe de prueba incluye
especificar los siguientes puntos:
a) Todos
los datos necesarios para la identificación completa de la muestra.
b) Los
resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8.
c) Cualquier
suceso particular observado durante el curso del análisis, así como cualquier
operación no especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber
influido en los resultados.
ANEXO V
METODO PARA LA
CUANTIFICACION DE HUEVOS DE HELMINTOS EN LODOS Y BIOSOLIDOS
El presente método tiene por
objeto establecer la técnica para la detección, enumeración, determinación y de
la viabilidad, en caso requerido, de huevos de helmintos en muestras de lodos y
biosólidos, con el fin de evaluar la calidad de estos subproductos y la
eficiencia de los sistemas de tratamiento a los que están sujetos.
1. Principio
La prueba se basa en el
siguiente principio:
1.1 Por
medio de lavados continuos, combinados con diversas etapas de filtración y
flotación se logra la separación de los huevos de helmintos del resto de las
partículas de mayor y menor tamaño, así como su concentración.
1.2 Permite,
en caso de ser requerido, determinar la viabilidad de los huevos de helminto y
con ello confirmar la calidad de diversos procesos de estabilización en lodos.
2. Muestreo, preparación y acondicionamiento de la muestra
El muestreo constituye una parte
integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de calidad del lodo,
por lo cual, éste deberá efectuarse de acuerdo con lo referido en el punto 5 de
esta Norma.
2.1 Preparar
recipientes de plástico inerte de 500 ml de boca ancha y de cierre hermético,
previamente desinfectados con cloro comercial, lavados con agua potable a
chorro y enjuagados con agua destilada.
2.2 A la
muestra, antes de ser procesada, se le determinará el contenido de sólidos
totales (ST) en por ciento en peso para, posteriormente, tomar en los
recipientes el peso en fresco (X) que corresponda a 2 g de ST, para todo tipo
de lodos.
2.3 Mantener
la muestra a una temperatura de 4°C ± 2°C
hasta su llegada al laboratorio.
2.4 A
partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en
refrigeración hasta su análisis.
3. Reactivos y materiales
3.1 Reactivos
3.1.1 Acetato
de etilo (C2H5 .OCOOCH3) (opcional).
3.1.2
Acetato de sodio trihidratado (CH3 COONa. 3H2O)
(opcional).
3.1.3
Acido acético (CH3 COOH) (opcional).
3.1.4
Acido sulfúrico 0,1 N (H2SO4).
3.1.5
Alcohol etílico (C2 H5 OH).
3.1.6
Agua destilada.
3.1.7
Eter etílico.
3.1.8
Hipoclorito de sodio10% (NaClO).
3.1.9
Formaldehído 37% (opcional).
3.1.10
Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 .7H2 O).
3.1.11
Tween 80 al 0,1%.
3.2 Materiales
3.2.1 Barras
magnéticas.
3.2.2
Bulbo de goma.
3.2.3 Embudo
de plástico con diámetro de 20 cm.
3.2.4 Espátula.
3.2.5 Gradillas
para tubos de centrífuga 50 ml.
3.2.6 Guantes
de látex.
3.2.7 Manguera
para conexión de matraz.
3.2.8 Matraces
aforados Erlenmeyer de 1 L de capacidad.
3.2.9 Matraz
Kitazato de 4 L.
3.2.10 Pipetas
de 10 ml de plástico.
3.2.11 Pizeta
de plástico de 1 L.
3.2.12 Probetas
graduadas de 10 ml, 50 ml y de 1 L.
3.2.13 Recipientes
de cierre hermético de 1 a 3 L de capacidad.
3.2.14 Recipientes
de plástico inerte con paredes internas lisas de 3 L de capacidad.
3.2.15 Recipientes
de plástico inerte, boca ancha, de 500 ml de capacidad y susceptibles de ser esterilizados en autoclave.
3.2.16 Tamiz
de 20 mm
(milimicras) de poro (opcional).
3.2.17 Tamiz
de 150 a 170 mm (milimicras) de poro.
3.2.18 Tapabocas.
3.2.19 Tubos
de centrífuga cónicos, de plástico 50 y 200 ml (o de mayor capacidad).
4. Aparatos y/o instrumentos
4.1 Agitador
de tubos con control de velocidad y adaptable a tubos de diferentes tamaños.
4.2 Autoclave
capaz de operar a una presión de 1,05 kg/cm2 y una temperatura de
121°C.
4.3 Balanza
granataria con intervalo de medición de 2,0 a 800 g ± 0,2 g.
4.4 Bomba
de vacío con control de velocidad de succión.
4.5 Cámara
de Sedgwich-Rafter o disco Doncaster.
4.6 Campana
de extracción.
4.7 Centrífuga,
capaz de mantener los intervalos de operación de 660 ± 300 g.
4.8 Densímetro
(hidrómetro), con intervalo de medición de 1,0 a 1,4 g/cm 3.
4.9 Incubadora
con capacidad para operar a una temperatura de 26°C ± 0,2°C.
4.10 Licuadora
con contenedor de plástico inerte, paredes lisas y con capacidad de 2 L.
4.11 Mascarilla
antigás con carbón activado o similar.
4.12 Microscopio
óptico equipado para hacer iluminación (Köhler), campo claro, con objetivos de
10 a 100 X, y platina móvil removible.
4.13 Parrilla
con agitación magnética.
4.14 Potenciómetro
con intervalo de medición de 0 a 14 ± 0,2 unidades de precisión.
4.15 Refrigerador
con capacidad para operar a una temperatura de 4°C ± 0,2°C.
5. Procedimiento
5.1 Preparación
de soluciones
Los siguientes puntos describen
la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo
descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.
5.1.1 Solución
ácido alcohol, homogeneizar 650 ml de ácido sulfúrico 0,1 N con 350 ml de
alcohol etílico. Almacenar la solución en un recipiente hermético.
5.1.2 Solución
de formalina al 0,5%, añadir 5 ml de formaldehído al 37% y aforar a 1 000 ml
con agua destilada. Homogeneizar y almacenar en recipiente hermético.
5.1.3 Solución
patrón de aceto-acético, agregar 15 g de acetato de sodio trihidratado, 3,6 ml
de ácido acético y aforar a 1 000 ml de agua destilada. Homogeneizar y
almacenar en frasco hermético durante 2
a 3 meses.
5.1.4 Solución
de sulfato de zinc (ZnSO4) con gravedad específica de 1,3. Disolver
800 g de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O) en 1
000 ml de agua destilada, mezclar en la parrilla magnética hasta homogeneizar
totalmente. Medir la densidad con el densímetro y, según sea el caso, ajustar
la densidad a 1,3 agregando sulfato de zinc o agua destilada, según se
requiera. Almacenar en recipiente hermético y verificar densidad cada mes.
5.1.5 Tween
80 al 0,1%, añadir 1 ml del reactivo en 999 ml de agua destilada y homogeneizar
en parrilla de agitación hasta su completa disolución. Almacenar en recipiente
hermético durante 2 a 3 meses.
5.2 Calibración
de aparatos
Todos los equipos deben ser
calibrados o ajustados de acuerdo con las especificaciones del fabricante, o
bien, contra equipos certificados.
5.3 Seguridad
5.3.1 Durante
el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de látex y cubreboca, para
evitar cualquier riesgo de infección.
5.3.2 Se
debe lavar y desinfectar el área de trabajo, así como el material utilizado por
el analista, antes y después del ensayo.
5.3.3 La
agitación de las soluciones con éter deberá realizarse en sitios ventilados o
dentro de una campana de extracción, considerando su inflamabilidad. Evitar la
inhalación, el contacto con los ojos, piel o ropa, ya que es un reactivo
sumamente tóxico.
5.4 Manejo
de residuos
5.4.1 Todos
los residuos de la muestra analizada serán esterilizados en autoclave antes de
su desecho.
5.4.2 Aquel
material que sea reutilizado, pero que no pueda ser esterilizado en autoclave
deberá ser colocado en hipoclorito de sodio (10%), durante un día, antes de ser
lavado.
5.5 Concentración
y separación de los huevos de helminto. La recuperación de los huevos de
helminto de la muestra se realizará efectuando los siguientes pasos:
a) Por 1
minuto y con la ayuda de una licuadora homogeneizar el peso en freso que
corresponda a 2 g de ST. Utilizar para ello 200 ml de una solución de Tween 80
al 0,1%, integrando los enjuagues del recipiente que originalmente contenía la
muestra.
b) Recuperar
homogeneizado y enjuagues del vaso de la licuadora en un recipiente de plástico
de 2 L, utilizar para ello 800 ml de la solución de Tween 80 al 0,1%.
c) Dejar
sedimentar la muestra al menos durante 3 horas.
d) Aspirar
el sobrenadante por vacío y filtrar el sedimento a través del tamiz de poro
seleccionado (150 a 170 mm). Enjuagar recipiente y tamiz con 1 L de agua
destilada, para lo cual se recomienda utilizar una pizeta. El filtrado y los
enjuagues se recuperan en el recipiente de plástico de 2 L.
e) Dejar
sedimentar al menos durante 3 horas.
f) Aspirar
el sobrenadante por vacío y recuperar sedimento y enjuagues, con agua
destilada, en un tubo de centrífuga de 200 ml o mayor capacidad.
g) Centrifugar
a 660 g durante 5 minutos.
h) Aspirar
el sobrenadante por vacío y desecharlo. Resuspender la pastilla en 150 ml de la
solución de sulfato de zinc. Homogeneizar la pastilla con ayuda de un agitador
de tubos y, sólo en caso de ser necesario, utilizar aplicadores de plástico o
espátula de teflón para lograr su completa disolución.
i) Centrifugar
a 660 g durante 5 minutos.
j) En
caso de contar con un tamiz de 20 mm de poro se recomienda efectuar
un segundo filtrado, cuya finalidad es remover el detritus de menor tamaño y facilitar
la lectura de los huevos de helminto en el sedimento final al microscopio. Para
ello, filtrar el sobrenadante y recuperar la película que ha quedado retenida
sobre la malla con el volumen de agua destilada que sea necesario (utilizar
pizeta), en un tubo de 200 ml de centrífuga, desechar filtrado y pasar al
inciso i. En caso contrario verter el sobrenadante en un recipiente de 2 L y
romper la densidad con 1 L de agua destilada.
k) Sedimentar
al menos durante 3 horas.
l) Una
vez transcurrido el tiempo de sedimentación aspirar el sobrenadante por vacío y
recuperar el sedimento resultante en un tubo de centrífuga de 200 ml o mayor
capacidad, incluir los enjuagues del recipiente.
m) Centrifugar
a 660 g durante 5 minutos.
n) Aspirar
el sobrenadante por vacío y resuspender el sedimento por agitación, con ayuda
de un agitador de tubos (si es necesario, utilizar aplicadores). La solución
resultante se recupera en un tubo cónico de centrífuga de 50 ml, incluyendo el
agua destilada de enjuague.
o) Centrifugar
a 660 g durante 5 minutos.
p) Aspirar
el sobrenadante y con ayuda de un agitador de tubos resuspender la pastilla en
15 ml de la solución de alcohol-ácido (u opcionalmente, el patrón de
aceto-acético) y, posteriormente, agregar 10 ml de éter (o acetato de etilo,
que es menos tóxico). Agitar suavemente y, de vez en cuando, destapar para
dejar escapar el gas que se desprenda. Por seguridad, realizar todo este
proceso dentro de la campana de extracción (en el laboratorio) o con mascarilla
de protección antigás (en campo).
q) Centrifugar
a 660 g durante 5 minutos.
r) Aspirar
el sobrenadante, hasta 2 mm por arriba de la parte cónica del tubo de 50 ml
(aproximadamente 5 ml). Realizarlo bajo las mismas condiciones de seguridad (en
el laboratorio) dentro de la campana de extracción o (en campo) con mascarilla
de protección antigás.
s) Efectuar
un primer enjuague agregando H2SO4 0,1 N (o formalina
0,5%).
t) Centrifugar
a 660 g durante 5 minutos.
u) Aspirar
el sobrenadante, dejando 5 ml y realizar un segundo enjuague agregando H2SO4
0,1 N (o formalina 0,5%).
v) Centrifugar
a 660 g durante 5 minutos.
w) Aspirar
el sobrenadante dejando 5 ml del mismo.
5.6 Determinación
de viabilidad y lectura al microscopio
a) Si no
es necesario determinar la viabilidad, proceder a la cuantificación, en caso
contrario, incubar el tubo con la muestra durante 4 semanas a 26°C ± 0,2°C.
Dejar la tapa del tubo floja para que entre aire y, por lo menos una vez por
semana, verificar que el nivel del líquido no disminuya. Si es necesario,
agregar
agua destilada.
b) Una
vez transcurrido el tiempo de incubación, homogeneizar la pastilla y proceder a
la cuantificación de los huevos. Para la lectura verter el sedimento final en
una celda de Sedgwich Rafter o Disco Doncaster. En caso necesario, y para evitar
la sobreposición de estructuras y del detritus no eliminado, distribuir en
alícuotas y homogeneizar con agua destilada. Sólo aquellos huevos donde se
observe la larva se consideran viables.
El Anexo 1 muestra algunos ejemplos.
c) Como
paso opcional, y antes de realizar la lectura al microscopio, añadir
hipoclorito de sodio (10%) en igual volumen al sedimento final y dejar reposar
durante 10 minutos. Aforar con agua destilada.
d) Centrifugar
a 660 g durante 5 minutos y decantar hasta dejar 5 ml del sobrenadante.
e) Realizar
un segundo enjuague con agua destilada y centrifugar bajo las mismas
condiciones.
Lo anterior permite una mayor claridad en el contenido interno de los huevos
(especialmente de Ascaris y Trichuris), una mejor diferenciación y,
en consecuencia, un conteo más rápido.
f) Aspirar
sobrenadante hasta 5 ml del volumen final.
6. Cálculos
6.1 La
fórmula para calcular g es:
g = r (rpm)
k
donde:
g = fuerza relativa de
centrifugación
k = constante cuyo valor es 89,
456
r = radio de la centrífuga en cm
rpm = revoluciones por minuto
6.2 Para
el cálculo del por ciento de sólidos totales (ST), se utiliza el % de humedad
como sigue:
% de sólidos totales = 100% -% de
humedad (2)
7. Expresión de resultados
% de
sólidos totales = 100% -% de humedad
7.1 Expresar
los resultados en número de huevos/2 g de sólidos totales (volumen de muestra
analizada).
H/2g
ST (3)
donde:
H = número de huevos leídos en
la muestra
gST = gramos de sólidos totales de
la muestra analizados
7.2 Interferencias
7.2.1 La
sobreposición de estructuras y/o detritus no eliminados en el sedimento puede
dar una evaluación errónea al dificultar la lectura. En tal caso, es importante
diluir con agua destilada y hacer las alícuotas que se consideren necesarias
para que en cada una se realice el conteo.
7.2.2 La
falta de experiencia en la identificación de géneros es un elemento común de
sobreconteo.
7.2.3 En
caso de que la muestra presente la formación de hongos durante el proceso de
incubación se recomienda remplazar el H2SO4 0,1 N por una
solución de formalina 0,5%.
8. Informe de la prueba
Incluye especificar los
siguientes puntos:
a) Todos
los datos necesarios para la identificación completa de la muestra.
b) Los
resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8.
c) Cualquier
suceso particular observado durante el curso del análisis, así como cualquier
operación no especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber
influido en los resultados.
ANEXO VI
METODO PARA LA
CUANTIFICACION DE METALES PESADOS EN BIOSOLIDOS
El presente método tiene por
objeto establecer la técnica para la
determinación de arsénico, cadmio, cobre, cromo, plomo, mercurio, níquel y
zinc, en muestras de biosólidos, por espectrofotometría de absorción atómica,
donde el análisis de los elementos se efectúa individualmente.
1. Principio
El método
analítico se basa en la atomización de la muestra para liberar los átomos, a
los que se les aplica una energía de una longitud de onda específica que es
absorbida e induce al electrón a pasar a un estado excitado. Esta energía
absorbida es proporcional a la concentración del elemento en la muestra
analizada.
2. Reactivos y materiales
2.1 Reactivos
2.1.1 Acido clorhídrico grado suprapuro.
2.1.2 Acido nítrico grado suprapuro.
2.1.3 Acido nítrico.
2.1.4 Acido perclórico grado suprapuro.
2.1.5 Acido sulfúrico grado suprapuro.
2.1.6 Acetona.
2.1.7 Agua tipo II, que tiene las siguientes
características: resistividad mayor de 10 egohm-cm a 25ºC y conductividad menor de 0,1 S/cm a 25ºC. En lo
subsiguiente se le llamará agua.
2.1.8 Aire comprimido seco y limpio.
2.1.9 Borohidruro de sodio.
2.1.10 Cadmio metálico.
2.1.11 Cloruro de mercurio.
2.1.12 Cloruro de potasio.
2.1.13 Cloruro o sulfato estanoso.
2.1.14 Cobre metálico.
2.1.15 Detergente no iónico, libre de metales.
2.1.16 Gases: acetileno, nitrógeno, grado absorción atómica.
2.1.17 Hexano.
2.1.18 Hidróxido de sodio.
2.1.19 Níquel metálico.
2.1.20 Nitrato de plomo.
2.1.21 Oxido de lantano.
2.1.22 Permanganato de potasio.
2.1.23 Soluciones estándar de referencia certificada de
arsénico, cadmio, cobre, cromo, plomo, níquel, mercurio y zinc, de 100 ppm.
2.1.24 Trióxido de arsénico.
2.1.25 Trióxido de cromo.
2.1.26 Zinc metálico.
2.2 Materiales
2.2.1 Crisoles de platino de 40
a 50 ml de capacidad.
2.2.2 Cápsula de porcelana de
50 ml de capacidad.
2.2.3 Embudos de filtración de
diferentes capacidades.
2.2.4 Goteros.
2.2.5 Matraces Erlenmeyer de
diferentes capacidades.
2.2.6 Matraces volumétricos de
diferentes capacidades.
2.2.7 Membranas de ruptura.
2.2.8 Micropipetas o pipetas
Eppendorf de diferentes capacidades.
2.2.9 Papel filtro Whatman número
40.
2.2.10 Pipetas volumétricas de
varias capacidades.
2.2.11 Puntas de plástico para
micropipetas.
2.2.12 Recipientes de
polietileno, propileno o de vidrio de 50 ml.
2.2.13 Vasos de precipitado de
diferentes capacidades.
2.2.14 Vaso de teflón de 100
ml.
2.2.15 Vidrio de reloj.
Todo el material volumétrico utilizado por este método
debe ser clase A y ser de uso exclusivo para este procedimiento.
3. Equipo
Sólo se mencionan los equipos que son de relevancia
para el presente método.
3.1 Balanza analítica con intervalo de medición de 0,0001
a 80 g ± 0,0001 g
3.2 Para la digestión de las muestras:
a) Parrilla de
calentamiento con regulador.
b) Horno de
microondas, capaz de liberar de 575 W a 1 000 W de potencia. El incremento de la
potencia debe ser mínimo 1%/s sistema de control de presión dentro de cada uno
de los vasos y sistema de ventilación de 2,8 m3/minuto.
c) Horno con
intervalo de temperatura de 0-160ºC.
d) Autoclave con
válvula de seguridad que se abra a 15 lb y un manómetro para indicar la presión
interna.
3.3 Espectrofotómetro de absorción atómica, con
lo siguiente:
a) Sistema
óptico. Fotómetro de haz sencillo o doble.
b) Monocromador
con rango espectral de 190 a 900 nm.
c) Ancho
de banda espectral de 0,2, 0,7 y 2,0 nm.
d) Sistema
de flama con control de gases.
e) Sistema
de generador de hidruros.
f) Sistema
de quemador con alineación de la flama manual o automática, y quemador de 10
cm.
g) Lámparas
de cátodo hueco o de descarga sin electrodo, de acuerdo a los metales a
analizar.
h) Interfase con
registrador o un adecuado sistema automatizado para el procesamiento de datos.
4. Recolección, preservación y almacenamiento de muestras
4.1 Recolección
La muestra debe tomarse en recipientes de polietileno
o de vidrio y boca ancha de 50 ml y llenando hasta el tope.
4.2 Preservación y almacenamiento de la muestra
La muestra debe refrigerarse inmediatamente a 4°C por
un tiempo máximo de 6 meses, excepto para el caso del mercurio que se requiere
analizar antes de 28 días.
5. Procedimiento
Los siguientes
puntos describen la secuencia del método de prueba, el que se debe realizar
conforme a lo descrito.
5.1 Preparación de disoluciones
5.1.1 Acido nítrico al 10% v/v.
Diluir 16 ml de HNO3 RA, en 100 ml de agua.
5.1.2 Acido clorhídrico al 15%
v/v. Diluir 40 ml de HCl RA, en 100 ml de agua.
5.1.3 Acido clorhídrico 1:1. Diluir 50 ml de HCl
RA con 50 ml de agua.
5.1.4 Acido clorhídrico al 1,5%
v/v. Diluir 3,4 ml de HCl en 100 ml de agua.
5.1.5 Solución de borohidruro de
sodio. Pesar 4 g de borohidruro de sodio en 100 ml de una solución de hidróxido
de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío.
5.1.6 Solución de hidróxido de
sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 ml con agua.
5.1.7 Solución de permanganato de potasio. Pesar 5
g de permanganato de potasio y diluirlo a 100 ml. Considerar el porcentaje de
pureza.
5.1.8 Agua regia. Añadir tres
volúmenes de HCl RA a un volumen de HNO3 RA.
5.1.9 Soluciones para realizar la
curva de calibración. A partir de la solución que se indica en el punto
3.1.2.3, realizar las diluciones necesarias con un pH = 2. Preparar mínimo
cinco concentraciones, las que deben estar en el intervalo de trabajo del
laboratorio.
5.1.10 Soluciones para verificar el 0,2 unidades de
absorbancia. A partir de la solución que se indica en el punto 3.1.2.3,
realizar las diluciones necesarias con un pH = 2, hasta obtener 2 ppm.
También se
pueden preparar estas soluciones en el laboratorio, como se indica a continuación,
siempre y cuando se verifique su concentración con una solución estándar de
referencia.
a) Arsénico:
Disolver 1,320 g de trióxido de arsénico, As2O3 en agua
conteniendo 4 g de NaOH. Diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml = 1.00 mg As
(III).
b) Cadmio: Disolver
0,10 g de cadmio metálico en 4 ml de HNO3, adicionar otros ocho ml
de HNO3 y diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml = 100 mg de Cd.
d) Cobre:
Disolver 0,10 g de cobre metálico en dos ml de HNO3, adicionar 10 ml
de HNO3 y diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml = 100 mg Cu.
e) Cromo:
Disolver 0,1923 g de CrO3 en agua. Cuando la disolución sea
completa, acidificar con 10 ml de HNO3, y diluir a 1 000 ml con
agua. 1,00 ml = 100 mg Cr.
f) Mercurio:
Disolver 0,1354 g de cloruro de mercurio, HgCl2, en aproximadamente
70 ml de agua, añadir un ml de HNO3 y diluir a 100 ml con agua. 1,00
ml = 1,00 mg Hg.
g) Níquel:
Disolver 0,10 g de níquel metálico en 10 ml de HNO3 caliente,
enfriar y diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml = 100 mg Ni.
h) Plomo:
Disolver 0,1598 g de nitrato de plomo, Pb(NO3)2,
en una mínima cantidad de HNO3 1:1, adicionar 10 ml de HNO3 y
diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml = 100 mg Pb.
i) Zinc: Disolver 0,100 g de Zinc metálico en
20 ml de HCl 1:1 y diluir a 1 000 ml en agua. 1,00 ml = 100 mg Zn.
El ácido
nítrico utilizado para la preparación de estas soluciones es grado suprapuro.
5.2 Limpieza
del material
5.2.1 El material de vidrio debe sumergirse durante una hora
en una disolución de ácido nítrico al 10% (ver 6.1.1) y enjuagarse con agua.
5.2.2 En caso de que el material presente adherencias, debe
dejarse remojando de 12 a 24 horas con ácido nítrico al 10% (6.1.1), o con
ácido clorhídrico 15% (ver 6.1.2) o con agua regia (ver 6.1.8). Después debe
ser enjuagado con suficiente agua, hasta remover toda la disolución ácida.
5.2.3 En los casos en que el material presente grasa,
agregarle acetona o hexano y distribuirlo por todas las paredes del material.
Desechar el disolvente de acuerdo al procedimiento de desechos y,
posteriormente, enjuagar con agua. Continuar como se indica en el punto 6.2.
5.2.4 Los recipientes de muestras deben lavarse con
disolución de detergente, enjuagarse con agua de la llave y dejarlo remojando
toda la noche en ácido nítrico al 10% (6.1.1). Posteriormente, enjuagarlo con
agua.
5.2.5 Verificar que el lavado de material se efectuó
correctamente.
5.2.6 Guardar en cuanto esté seco
para evitar contaminación por partículas en el aire.
5.3 Preparación de la muestra
Las muestras de
lodos y biosólidos, requieren, en general, un tratamiento previo antes del
análisis. Los metales totales incluyen la combinación de los que se encuentran
en la fase orgánica y en la inorgánica, así como los disueltos y en partículas.
Notas:
a) Durante
todo el procedimiento analítico donde se mencione utilización de ácidos, éstos
deben ser grado suprapuro.
b) Procesar
las muestras de control establecidas en su programa de AC, por cada serie de
digestión.
5.3.1 Digestión por horno
Homogeneizar
perfectamente la muestra, verificando que no existan sólidos adheridos en el
fondo del recipiente. En seguida, vaciar aproximadamente 10 g en una cápsula de
porcelana (a peso constante) y colocarla en el horno hasta que el material esté
a peso constante. El horno debe estar a 100ºC.
5.3.2 Digestión por parrilla
5.3.2.1 Pesar y registrar de uno a
dos gramos de la muestra en un vaso de precipitado de 100 ml o en un crisol de
platino y añadir 10 ml de HNO3 concentrado. Cubrir con un vidrio de
reloj y calentar lentamente hasta que exista reflujo de vapores, cuidando que
no alcance la temperatura de ebullición. Calentar casi a sequedad.
5.3.2.2 Enfriar y lavar el vidrio de
reloj con agua. Adicionar otros 5 ml de HNO3 concentrado. Cubrir y
continuar calentando hasta digestión completa, que es cuando la solución
adquiere apariencia cristalina y los vapores son blancos. Agregar el ácido
necesario para obtener esto.
5.3.2.3 Evaporar hasta obtener un volumen aproximado de 2 ml,
enfriar y enjuagar el vidrio de reloj con agua. Añadir 10 ml de HCL 1:1 (ver
6.1.3) y 15 ml de agua. Calentar nuevamente por 15 minutos para redisolver
precipitados que se hayan formado.
5.3.2.4 Enfriar, enjuagar las
paredes del vaso y vidrio de reloj con agua. Vaciar el contenido a un matraz
volumétrico de 50 ml, filtrando a través de papel filtro número 40, para remover
el material insoluble que pueda tapar el nebulizador. Aforar al volumen
correspondiente.
5.3.3 Digestión por autoclave
5.3.3.1 En un vaso de teflón de 100
ml, transfiera 0,5 g de la muestra seca. Marque y pese los vasos antes y
después para obtener el peso exacto de la muestra.
5.3.3.2 Añadir 5 ml de HNO3,
tapar los recipientes herméticamente y la autoclave. Encender el equipo y
dejarlo en operación a 15 lb, aproximadamente una hora. El laboratorio debe
validar el tiempo de digestión, con el equipo que utilizará para tal fin.
5.3.3.3 Sacar y enfriar a temperatura ambiente los vasos de
teflón.
5.3.3.4 Abrir y filtrar a través de
papel filtro número 40, si se requiere, para retener materiales insolubles.
Lavar las paredes con agua y diluir la muestra a 50 ml.
5.3.4 Digestión por horno de
microondas
Para usar el
horno de microondas como fuente de energía, en la digestión de la muestra, se
sigue el mismo procedimiento descrito en el
punto 6.3.3, excepto que el tiempo de la digestión puede variar de 30 a 50 min
dependiendo de las características de la muestra y de la potencia aplicada.
5.4 Análisis instrumental
5.4.1 Determinación de cadmio, cobre, cromo, níquel, plomo
y zinc, por aspiración directa flama-aire-acetileno.
5.4.1.1 Conectar la lámpara de cátodo hueco o descarga sin
electrodos y encender el equipo.
5.4.1.2 Seleccionar la longitud de onda y el ancho de banda
espectral de acuerdo al metal a analizar, siguiendo el protocolo del
laboratorio o el manual del fabricante. En la tabla 1 se proponen las longitudes
de onda y el ancho de banda espectral con los que se pueden analizar los
elementos.
Tabla 1. Relación de longitud y ancho de banda para
los elementos analizados por flama
Elemento |
Longitud de onda (l) |
Ancho de banda espectral (nm) |
|
Cd |
228,8 |
0,7 |
|
Cr |
357,9 |
0,7 |
|
Cu |
324,8 |
0,7 |
|
Ni |
232,0 |
0,7 |
|
Pb |
217,0 |
0,7 |
|
Zn |
213,9 |
0,7 |
5.4.1.3 Alinear la
lámpara vertical, horizontal y rotacionalmente, hasta obtener la máxima
energía.
5.4.1.4 Esperar de 10 a
20 minutos para que se estabilice el instrumento.
5.4.1.5 Ajustar las
condiciones de la flama aire-acetileno, de acuerdo con las indicaciones del
fabricante. Encender la flama. Permitir que el sistema alcance el equilibrio de
temperatura.
5.4.1.6 Aspirar el
blanco y ajustar el instrumento a cero.
5.4.1.7 Aspirar la
disolución del estándar (5.1.10) con la concentración necesaria (ver tabla 2)
para obtener 0,2 unidades de absorbancia. Ajustar con esta disolución el
instrumento y si es necesario también ajustar el quemador, hasta obtener el
valor más cercano a 0,2 unidades de absorbancia.
Tabla 2. Relación de concentraciones para
calibración del instrumento utilizando flama
|
Elemento |
Concentración ppm |
|
Cd |
1,5 |
|
Cr |
4,0 |
|
Cu |
2,0 |
|
Ni |
7,0 |
|
Pb |
9,0 |
|
Zn |
1,0 |
5.4.1.8 Aspirar las
disoluciones estándar, mínimo cinco concentraciones (ver 5.1.10), para realizar
la curva de calibración y un blanco de reactivos. El primer punto debe ser
igual o mayor al límite de cuantificación del método y el último debe estar
dentro del intervalo lineal.
5.4.1.9 Proceder a
analizar las muestras problema y las muestras control. Si las lecturas de las
muestras están fuera del intervalo de la curva de calibración, efectuar la(s)
dilución(es) que sean necesarias, hasta obtener valores en el intervalo de
trabajo.
5.4.2 Determinación de mercurio y arsénico por generador
de hidruros.
5.4.2.1 Instalar la
lámpara correspondiente al metal que se va a analizar en el instrumento y
encenderlo. Esperar de 20 a 30 minutos para su estabilización.
5.4.2.2 Seleccionar la
longitud de onda y el ancho de banda espectral. En la tabla 3 se proponen las
longitudes de onda y ancho de banda para cada uno de los elementos.
Tabla 3. Relación de longitud y ancho de banda para
los
elementos analizados por generador de hidruros
|
Elemento |
Longitud de onda (l) |
Ancho de banda espectral (nm) |
|
As |
193,7 |
0,7 |
|
Hg |
253,7 |
0,7 |
5.4.2.3 Alinear la
lámpara vertical, horizontal y rotacionalmente, hasta obtener la máxima
energía.
5.4.2.4 Alinear la
celda de cuarzo vertical, horizontal y rotacionalmente, hasta obtener la mínima
energía. Esperar de 20 a 30 minutos para su estabilización.
5.4.2.5 Ajustar y
optimizar los flujos de aire-acetileno y encender la flama. Esperar
aproximadamente 10 minutos para su estabilización. Este ajuste sólo se requiere
para la determinación de arsénico.
5.4.2.6 Abrir el tanque
de nitrógeno y ajustar la presión de acuerdo a las especificaciones del
fabricante, para transportar el hidruro formado a la celda de cuarzo.
5.4.2.7 Colocar en el
recipiente del reductor la disolución de borohidruro de sodio (ver punto 5.1) y
conectar al sistema según las especificaciones del instrumento.
5.4.2.8 Conectar el
vaso de reacción vacío al sistema generador y esperar el tiempo suficiente a
que se estabilice el sistema. Cuando se ha estabilizado, registrar el cero en
el espectrofotómetro (autocero). Retirar
el vaso.
5.4.2.9 Conectar otro
vaso de reacción con 10 ml de HCl 1,5%, permitir la entrada del hidruro formado
y registrar el cero. Repetir esta operación hasta obtener el cero por lo menos
tres veces. Retirar el vaso.
5.4.2.10 Vaciar en otro
vaso de reacción, 10 ml de disolución estándar, para obtener el 0,2 unidades de
absorbancia. En la tabla 4 se indican las concentraciones, con las que se
obtiene el 0,2 unidades de absorbancia. Repetir esta operación hasta que se
obtenga por lo menos tres veces la misma lectura, la cual deberá ser
aproximadamente de 0,2. En caso de existir variación en las lecturas, verificar
la alineación de la lámpara y de la celda de cuarzo.
Tabla 4. Relación de concentraciones para
calibración del
instrumento utilizando generador de hidruros
|
Elemento |
Concentración, ng |
|
As |
5 |
|
Hg |
50 |
5.4.2.11 De forma
similar al punto anterior, realizar la curva de calibración con un mínimo de
cinco concentraciones y por lo menos tres lecturas independientes. Limpiar el
sistema haciendo pasar ácido clorhídrico al 1,5% cada tres lecturas.
5.4.2.12 Una vez determinada
la curva de calibración, proceder a analizar el blanco, las muestras problema y
las muestras control, como se indica en los dos puntos anteriores. Si las
lecturas de las muestras están fuera del intervalo de la curva de calibración,
efectuar la(s) dilución(es) que sean necesarias, hasta obtener valores en el
intervalo de trabajo.
6. Calibración
Todos los instrumentos y materiales de medición utilizados, deben ser
calibrados y verificar su calibración periódicamente con materiales y/o
sustancias de referencia certificadas, de acuerdo con el AC establecido.
6.1 Verificación de la calibración espectrofotómetro de
absorción atómica
Independientemente del elemento a
analizar, realizar dicha verificación del instrumento como se indica a
continuación.
6.1.1 Conectar la lámpara de
cobre y encender el equipo.
6.1.2 Seleccionar la longitud
de onda a 324,8 nm y el ancho de banda a 0,7 nm.
6.1.3 Alinear la lámpara
horizontal, vertical y rotacionalmente, hasta obtener la máxima energía.
6.1.4 Una vez encendida la
lámpara y alineada, esperar de 10 a 20 min. para la
estabilización
del instrumento.
6.1.5 Ajustar las condiciones
de la flama aire-acetileno, de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
Encender la flama. Permitir que el sistema alcance el equilibrio de
temperatura.
6.1.6 Aspirar un blanco.
6.1.7 Aspirar una disolución
estándar de cobre de 2 ppm (ver punto 5.1.10), la que debe dar 0,2 unidades de
absorbancia, ± lo establecido en los resultados obtenidos de las validaciones
analíticas.
7. Cálculos
7.1 Interpolar los
valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de
calibración, para obtener la concentración en mg/l (A). En seguida realizar los
cálculos, tomando en cuenta los factores de dilución y peso de la muestra con
la fórmula siguiente:
(2)
donde:
A: Concentración en mg/l de la muestra a
interpolar en la curva de calibración.
B: Volumen al que se llevó la muestra
(ml).
C: Peso de la muestra (g).
FD: Factor de dilución.
En los
instrumentos que tienen integrado un procesador de datos, se puede obtener
directamente la concentración del elemento.
7.2 Reporte de resultados
7.2.1 No se deben reportar concentraciones de elementos por
debajo del límite de cuantificación.
7.2.2 Reportar los resultados del análisis en mg/kg.
8. Interferencias
Probablemente no existirá nunca un método analítico
que esté totalmente libre de alguna interferencia por parte de la naturaleza de
la muestra, sin embargo, en absorción atómica, por ser una técnica muy
específica, las interferencias están bien definidas como también los medios
para su tratamiento.
8.1 Interferencia por matriz: la principal interferencia
para este tipo de muestras es la presencia de materia orgánica y sólidos en
suspensión, lo que se elimina mediante una adecuada digestión de la muestra.
8.2 Interferencia de absorción no específica (fondo). La
absorción molecular y la dispersión de la luz causadas por partículas sólidas
en la flama pueden causar errores positivos. Para evitar este problema se debe
utilizar la corrección de fondo del instrumento. Estos sólidos además de
presentar una barrera física al paso de la luz de la lámpara en la flama, forman
depósitos en la cabeza del quemador, sin embargo, esto se puede evitar
aspirando continuamente agua acidulada.
8.3 Interferencias físicas. Están relacionadas con las
diferentes propiedades existentes entre las muestras y los estándares. Las
cuales pueden afectar a la aspiración y eficiencia de nebulización en el
sistema de atomización. Si las soluciones presentan diferencias de viscosidad
y/o tensión superficial, la eficiencia de nebulización no será igual y los
resultados analíticos se ven afectados. La presencia de otros compuestos además
del elemento de interés puede afectar a los resultados analíticos. Estas
interferencias pueden ser corregidas utilizando el método de adición interna
(adición de estándares).
8.4 Las interferencias en generador de hidruros se
presentan por presencia de otros elementos o moléculas presentes en la muestra.
Los efectos se ven reflejados en una disminución de la cantidad de hidruro
formado y, por lo tanto, en una disminución de la señal analítica. La forma de
eliminar este tipo de interferencias es modificando la concentración del ácido
y/o del borohidruro de sodio.
9. Manejo de residuos
9.1 Cada laboratorio debe considerar dentro de su programa
de control de calidad (CC) el tratamiento de los residuos generados durante la
determinación.
9.2 Confinamiento. El laboratorio debe contar con áreas
especiales, que tengan señalamientos adecuados, para almacenar temporalmente
las soluciones contaminadas con metales pesados.
9.3 Todas las muestras que cumplan con la norma de descarga
al alcantarillado pueden descargarse en el mismo.
ANEXO
VII
CONTENIDO
DE LA BITACORA DE CONTROL DE LODOS Y BIOSOLIDOS
1.- Generador
2.- Producción en base seca (Ton.) por: día y mes
3.- Fecha muestreo
4.- Laboratorio que analizó
5.- Salida del producto:
— fecha
— cantidad en base seca (Ton.)
—
destinatario
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